Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um<em> In Vitro</em> Sistema
Summary
Este protocolo descreve técnicas para a quantificação e caracterização de aberrações cromossómicas in vitro em macrófagos de camundongos RAW264.7 após o tratamento com partículas do ar ambiente.
Abstract
A exposição a partículas (PM) é um importante problema de saúde mundial, que pode danificar vários componentes celulares, incluindo o material genético nuclear. Para avaliar o impacto da PM na integridade genética nuclear, aberrações cromossómicas estruturais são marcados nos spreads metáfase de macrófagos do rato RAW264.7. PM é recolhida a partir do ar ambiente com um amostrador de partículas totais alto volume suspenso. O material recolhido é solubilizado e filtrou-se para reter a porção fina solúvel em água. As partículas são caracterizadas por composição química por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Diferentes concentrações de suspensões de partículas são adicionados para uma cultura in vitro de macrófagos de ratinho RAW264.7 para um tempo total de exposição de 72 horas, juntamente com as células de controlo não tratadas. No final da exposição, a cultura é tratada com colcemida para prender células em metafase. As células são então recolhidas, tratou-se com uma solução hipotónica, fixo em acetomethanol, dropped em lâminas de vidro e, finalmente, corados com solução de Giemsa. Slides são examinados para avaliar as aberrações estruturais cromossómicas (CAs) em metáfase se espalha de 1000X ampliação usando um microscópio de campo brilhante. 50 a 100 metafase são marcados para cada grupo de tratamento. Esta técnica é adaptado para a detecção de aberrações estruturais cromossómicas (CAs), como quebras de tipo chromatid, trocas do tipo chromatid, fragmentos acêntricos, cromossomas dicêntricos e anel, minutos duplos, endorreduplicação, e translocações Robertsonianas in vitro após exposição a PM. É um método poderoso para associar um ponto de extremidade citogenética bem estabelecida a alterações epigenética.
Introduction
Estima-se que a exposição ao material particulado (PM) faz com que mais de 3 milhões de mortes em excesso por ano, principalmente por doenças cardiopulmonares e cancro do pulmão 1. Na verdade, PM foi reconhecido como carcinogênico para humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre Câncer (Grupo 1), com um risco aumentado de câncer de pulmão com o aumento dos níveis de exposição a PM foi mostrado 2. Curiosamente, quase todas as células cancerosas abrigar anormalidades cromossômicas numéricas e / ou estruturais. carbono orgânico particulado é uma variante, complexo e mistura heterogénea, cuja composição e tamanho de distribuição depende das emissões, bem como as transformações físicas e químicas. É responsável 35-55% da massa urbana PM 2,5 (PM 2,5 mm de tamanho e menores) e mais de 60% do fundo rural e continental PM 2,5 em massa 3, 4. A fração solúvel em água é responsável por 30-90% dos aerossóis orgânicos. Um grande número de compostos orgânicosForam identificados, incluindo os hidrocarbonetos alifáticos, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, e seus derivados oxigenados e nitrados, aldeídos alifáticos e álcoois, ácidos gordos livres e os seus sais, ácidos di-carboxílicos, compostos multifuncionais, proteínas e macromoléculas húmicos-like (HULIS) usando métodos cromatográficos acoplados com técnicas de espectrometria de massa 5-8. Estes compostos representam menos de 10-20% do carbono orgânico particulado, assim, a maioria de carbono orgânico é desconhecida 9.
A evidência experimental sugere que a citotoxicidade, o stress oxidativo, e a inflamação estão envolvidos no desenvolvimento de estados patológicos PM-associados. Recentemente, foi mostrado, no entanto, que a exposição a PM também resulta num certo número de alterações epigenética, incluindo alterações na metilação do ADN de elementos repetitivos, tanto experimental em sistemas in vitro e em indivíduos humanos 10-12. De particular interesse são os efeitos dePM em DNA satélite – maiores e menores satélites – que são encontrados na região heterocromática em torno do centrômero dos cromossomos. Mostrou-se que estes efeitos podem ser persistente, por natureza, uma vez que pode ser detectado durante pelo menos 72 horas após a exposição 12. Alterações na metilação do ADN, em particular ao redor de centrómeros, pode levar a uma acumulação de transcritos de ARNm de ADN cromossómico por satélite, integridade compromisso durante a divisão celular e, subsequentemente, resultam no desenvolvimento de uma variedade de estados patológicos 13.
Adaptação de abordagem citogenética para a análise de CAs como um ponto final de alterações epigenética causadas por PM, portanto, é de grande importância. Aqui, nós relatamos a abordagem para a recolha PM ambiente e preparação, a exposição in vitro e análise de CAs usando o murino sistema de macrófagos modelo RAW264.7. Os macrófagos compreendem a primeira linha de defesa contra os objectos estranhos inaladas e, por conseguinte, tsua linha celular serve como um modelo mais utilizado em toxicologia partícula 11, 12, 14, 15 e estabelecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
estudo de citogenética ou análise microscópica dos números ou estruturas de cromossomos, principalmente nos spreads metáfase, fornece informações cruciais para o prognóstico, avaliação de risco e tratamento de várias doenças. está agora bem estabelecido que anomalias citogenéticas estão associados com a progressão e desenvolvimento de várias doenças, incluindo câncer. Até à data, as CAs foram encontrados em todos os principais tipos de tumores. CAs pode surgir espontaneamente ou por qualquer estímu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado, em parte, pelo Instituto Nacional do Centro de Pesquisa Biológica Excelência [número de concessão 1P20GM109005], o Grant Consortium Arkansas espaço através do National Aeronautics and Space Administration [número de concessão NNX15AK32A] Saúde e do Instituto Nacional de Segurança Ocupacional e saúde (NIOSH) [número de concessão 2T420H008436]. Os autores gostariam de agradecer a Christopher Fettes para revisão e edição deste manuscrito.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
Referências
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