를 사용하여 주변 입자상 물질에 의한 염색체 수차 분석<em> 체외</em> 시스템
Summary
이 프로토콜은 대기 입자상 물질로 치료 한 후 마우스 RAW264.7 대 식세포 관내에서 정량 및 염색체 이상 특성화를위한 기술을 설명한다.
Abstract
입자상 물질 (PM)에 노출되면 핵의 유전 물질을 포함하는 다양한 세포 성분을 손상시킬 수 있습니다 세계 주요 건강 문제이다. 핵 유전자의 무결성에 대한 PM의 영향을 평가하기 위해, 구조 염색체 이상은 마우스 RAW264.7 대식 세포의 중기 스프레드로 획득된다. PM은 높은 볼륨의 총 부유 입자 샘플러와 주변 공기에서 수집됩니다. 회수 된 물질은 용해 및 수용성 미세한 부분을 유지하기 위해 여과 하였다. 입자를 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 화학 조성을 특징으로한다. 입자 현탁액의 상이한 농도는 미처리 대조군 세포와 함께 72 시간의 총 노출 시간 동안 RAW264.7 마우스 대식 세포의 시험 관내 배양에 첨가된다. 노광 끝에서 배양 중기 세포 체포 colcemid로 처리된다. 세포를 수확, acetomethanol에 고정 저장성 용액, D로 치료유리 슬라이드 상 ropped 최종적 김사 용액으로 염색. 슬라이드는 명 시야 현미경을 사용하여 1000 배의 배율에서 중기 스프레드 구조 염색체 수차 (CAS)에서 평가하기 위해 조사된다. 50 ~ 100 중기 확산은 각 치료 그룹습니다된다. 이 기술은 이러한 염색 분체 형 나누기, 염색 분체 형 교류, acentric 조각, dicentric 및 링 염색체, 두 분, endoreduplication, 그리고 오후에 노출 된 후 체외에서 로버트슨 전좌 등의 구조적 염색체 이상 (CAS)의 검출에 적합하다. 후생 유전 학적 변화에 잘 확립 된 세포 유전 학적 엔드 포인트를 연결하는 강력한 방법이다.
Introduction
입자상 물질 (PM)에 대한 노출은 주로 심폐 질환과 폐암 1에서 매년 3 백만 초과 사망, 원인 것으로 추정되고있다. 오후에 노출 수준을 증가 폐암의 위험이 증가 2에 도시 된 바와 같이 실제로, 오후, 암 연구를위한 국제기구 (그룹 1)에 의해 인간에게 발암 물질로 인식되었다. 흥미롭게도, 거의 모든 암세포 수치 및 / 또는 구조 염색체 이상 항구. 미립자 유기 탄소는 조성 및 크기 분포 배출뿐만 아니라 물리적, 화학적 변형에 따라 변형, 복잡한 이기종 혼합물이다. 그것은 35-55 (크기 PM 2.5 μm의 작은) 도시 PM 2.5 질량 %와 농촌 대륙 배경 PM 2.5 질량 3, 4의 60 % 이상에서 차지하고있다. 수용성 분획은 유기 에어로졸의 30-90%를 차지한다. 유기 화합물의 대다수지방족 탄화수소, 다환 방향족 탄화수소, 및 산소 및 니트로 유도체, 지방족 알데히드 및 알콜, 유리 지방산 및 그 염, 디 – 카르 복실 산, 다작 용성 화합물, 단백질, 및 부식과 같은 거대 분자 (HULIS) 사용을 포함하여 식별 된 질량 분석 기술 5-8 결합 크로마토 그래피 방법. 따라서 이들 화합물은 유기 탄소의 대부분은 9 불명 미립자 유기 탄소 미만 ~ 20 %를 나타낸다.
실험적 증거는 세포 독성, 산화 스트레스, 염증이 PM 관련된 병적 상태의 발전에 관여하는 것을 시사한다. 또한 최근 그러나, PM 해당 노출 시험 관내 시스템에서 인간 피험자 10-12 모두 실험에서, 반복 요소의 DNA 메틸화의 변화를 포함 후성 변경하는 다수의 결과 밝혀졌다. 특히 관심의 효과가있다메이저와 마이너 위성 – – 염색체의 센트로 주변의 염색질 지역에서 발견되는 위성 DNA에 오후. 그것은 그들이 노출 (12) 후 최소 72 시간 동안 감지 할 수있는 이러한 효과는 자연에 의해 지속 할 수 있음을 보였다. 특히 중심절 주위 DNA 메틸화의 변화는 세포 분열 동안 위성 DNA의 mRNA의 성적 증명서, 타협 염색체 무결성의 축적으로 이어질하고, 그 후, 병리학 적 상태 (13)의 다양한 개발 될 수 있습니다.
PM에 의한 후생 유전 학적 변화의 단부 점과 CA의 유전 학적 분석 방법의 적응하므로 높은 중요하다. 여기서, 우리는 뮤린 대 식세포 RAW264.7 모델 시스템을 사용하여 시험 관내의 CA 노광 분석 주위 PM 수집 및 제조를위한 방법을보고한다. 대 식세포는 t 따라서, 흡입 된 이물질을 우선적으로 보호를 포함하고,그의 세포주 확립 입자 독성학 11, 12, 14, 15에서 가장 자주 사용하는 모델로서 기능한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 유전 학적 연구 또는 번호 또는 주로 중기 스프레드 염색체의 구조의 현미경 분석, 각종 질병에 대한 예후, 위험 평가, 치료에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 지금 세포 유전 학적 이상이 암 등 여러 질병의 진행 및 개발과 연결되어 있음을 잘 설정됩니다. 현재까지, CA는 모든 주요 종양 유형에서 발견되었다. 유전 학적 변화 (16)의 다양한 형태를 유도 할 수있는 주요 외부의 위험 인…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 생물학 연구 우수성 [허가 번호 1P20GM109005, 국립 항공 우주국 [부여 번호 NNX15AK32A]를 통해 아칸소 공간 부여 컨소시엄의 건강 센터의 국립 연구소 및 산업 안전에 대한 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원 건강 (NIOSH) 인증 번호 2T420H008436]. 저자는 교정이 원고를 편집 크리스토퍼 Fettes에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
Referências
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- . . IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
