Summary

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

Published: September 27, 2016
doi:

Summary

We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

Abstract

Wir beschreiben eine kostengünstige, konfigurierbar morbidostat für den Evolutionsweges der Antibiotikaresistenz zu charakterisieren. Die morbidostat ist eine bakterielle Kulturvorrichtung, die kontinuierlich das Bakterienwachstum überwacht und reguliert dynamisch die Arzneimittelkonzentration, die Bakterien ständig herausfordern, wie sie Arzneimittelresistenz zu erwerben entwickeln. Das Gerät verfügt über ein Arbeitsvolumen von ca. 10 ml und ist voll automatisiert und mit Messung der optischen Dichte und Mikropumpen für mittlere und Medikamentenabgabe ausgestattet. Um die Plattform zu validieren, maßen wir die schrittweise Übernahme von Trimethoprim Resistenz in Escherichia coli MG 1655 und integriert , um die Vorrichtung mit einer Mikrofluidik – Multiplex – Plattform Zellmorphologie und Antibiotikaempfindlichkeit zu untersuchen. Der Ansatz kann auf Laboruntersuchungen von Antibiotika-Resistenzen hochskaliert werden, und ist verlängerbar Evolution für Stamm Verbesserungen in Metabolic Engineering und andere Bakterienkultur Experimente adaptiv.

Introduction

Seit der Einführung des ersten Antibiotikums Penicillin hat mikrobielle Antibiotika – Resistenz in ein Problem der globalen Gesundheit entwickelt 1. Obwohl der Erwerb von Antibiotika – Resistenzen können nachträglich in vivo untersucht werden, werden die Bedingungen dieser Versuche häufig nicht während der gesamten Evolution 2 gesteuert. Alternativ können adaptive gerichtete Evolution offenbaren die molekulare Evolution einer mikrobiellen Spezies unter Umweltbelastungen oder Selektionsdruck aus einem Antibiotikum 3. In jüngster Zeit haben viele gut kontrollierten evolutionäre Experimente von Antibiotika-Resistenzen, die Entstehung von Antibiotika-Resistenzen aufgeklärt. Zum Beispiel zeigte Austin Gruppe rasche Entwicklung in einem richtig entwickelt mikrofluidische compartmented Umwelt 4. Die neu entwickelte morbidostat induziert systematische Mutationen unter Drogenselektionsdruck 5,6. Die morbidostat, eine mikrobielle selecGerät werden , die die Antibiotika – Konzentration kontinuierlich einstellt eine nahezu konstante Bevölkerung zu erhalten, ist ein großer Fortschritt von der Fluktuationstest in der Mikrobiologie verwendeten 7,8. Im Fluktuationstest, ein Antibiotikum Medikament wird in hoher Konzentration injiziert, und die überlebenden Mutanten werden gesiebt und gezählt. Stattdessen Mikroben in einem morbidostat werden ständig in Frage gestellt und mehrere Mutationen erwerben.

Die morbidostat arbeitet ähnlich der Chemostat, eine Kulturvorrichtung von Novick und Szliard 1950 erfunden , die Nährstoffe durch kontinuierliche Zufuhr während Verdünnen der Mikrobenpopulation 9 eine konstante Population aufrecht erhält. Seit seiner Einführung hat sich die Chemostat wurde weiterentwickelt und verbessert. Aktuelle mikrofluidischen Chemostate haben Nano- und Einzelzellen-Kapazitäten erreicht. Jedoch sind diese Vorrichtungen nicht für adaptive Evolutionsexperimenten, die eine große Zellpopulation mit vielen Mutationsereignisse 10,11 erfordern. Vor kurzem Mini-Chemostate mit einem Arbeitsvolumen von ca. 10 ml wurden ebenfalls entwickelt in den Spalt zwischen Liter Bioreaktoren und der mikrofluidischen chemostat 12,13 zu füllen.

Hier präsentieren wir das Design und die Verwendung eines Low-Cost, automatisierte morbidostat für ein Antibiotikum drug resistance Studie. Das vorgeschlagene Modul kann mit minimalen Hardware-Anforderungen in einem Schüttelinkubator in einem mikrobiologischen Labor eingesetzt werden. Die Open-Source – Firmware auch leicht an spezifische Anwendungen der adaptiven Evolution zugeschnitten, wie Metabolic Engineering 3. Schließlich wird die morbidostat in ein Multiplex – Mikrofluidik – Plattform integriert für die Antibiotika – Resistenzprüfung 14.

Protocol

1. Montage und Vortests des Morbidostat Geräte Die Montage des Morbidostat Lochen 3 Löcher auf der Kappe des Kulturfläschchen mit einer 18 G Spritzennadel. Schneiden drei Stück Polyethylenschlauch ~ 7 cm in der Länge. Legen Sie diese drei Stücke aus Polyethylenschlauch auf der Kappe. Verwenden Sie Klebeband den Rand der Kappe zu wickeln, wie die Besetzung für das Polydimethylsiloxan (PDMS) Mischung zu dienen. Mischungs 5 ​​g A-Komponente und 0,5 g B-Komponente der PDMS in einem 1…

Representative Results

Die oben beschriebene morbidostat ist in 1. Die gemeinsamen morbidostat Operationen, einschließlich der experimentellen Entwicklung, antibiotische Empfindlichkeitstest und Zellmorphologie Prüfung, validiert wurden in einem E. schematisierte coli MG1655 Kultur Trimethoprim (TMP) ausgesetzt, ein häufig verwendetes Antibiotikum 5,6. TMP induziert sehr ausgeprägte schrittweise Erhöhungen der Arzneimittelresistenz und die Mutationen sind um d…

Discussion

Ein Low-Fußabdruck morbidostat Gerät von Low-Cost-Komponenten demonstriert. Der Anstieg der Widerstandsniveau Medikament vom Gerät registriert sind konsistent mit denen früherer Berichte 5. Entwickelt für evolutionäre Studien der Arzneimittelresistenz ist das Gerät möglicherweise auf viele andere Experimente. Zunächst wird eine umfassende Datenbank von Medikamenten-induzierten Mutationen können für einen großen Satz von klinisch relevanten Antibiotika hergestellt werden. Zum Beispiel kann die evol…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.

Materials

Environmental Shaker Incubator BioSan ES-20
Arduino Leonardo board Arduino Leonardo
680 Ohm Carbon Resistor Digikey Bias resistor for LED
100k Ohm Carbon resistor Digikey Bias resistor for phototransistor
940 nm light emitting diode Bright LED Electronic BIR-BM13E4G-2 Optical density measurement
940 nm phototransistor Kodenshi  ST-2L2B Optical density measurement
Darlington pair IC Toshiba Mouser ULN2803APG  this IC drives micropumps and magnetic stirring unit
5V DC brushless fan  ADDA AD0405LX-G70 spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com
Piezoelectric micropump CurieJet PS15I-FT-5L Pressure >3kPa  Flow rate >5 ml/min
Tygon 3350 Tuning Saint Gobain ABW00001 ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
Magnetic Stir bar COWIE tapered shape dim: 10 mm x 4mm
Glass scintillation 20ml vial DGS Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h)
Culture vial holder Custom made from Polyformaldehyde 
Silicone  Dow Corning Sylgald 184 used to seal the glass vial
Medium bottle VWR 66022-065
Difco M9 minimal salt 5x BD Medium
Cadamino Acid BD Medium
glucose Sigma
Agar Bateriological Oxoid for agar plate
Luria Bertani medium
Inverted microscope Leica Microsystems Leica DMI-LED used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55
Microscope Incubator Live Cell Instrument CU-109 used for microfluidic measurement
Solenoidal valves Pneumadyne S10MM-31-12-3 Normally open 1.3 Watt 12 Vdc
USB interface card Hobby Engineering USBIO24-R Digital I/O Module  for microfluidics measurement
Air compressor Rocker Scientific ROCKER 440 Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi
Male luer-lock fittings to 1/8" barb ValuePlastics.com MTLL230-1 used for microfluidic control
1/8" barb to 10-32 threaded port ValuePlastics.com B-1 used for microfluidic control
Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port ValuePlastics.com KFTL-1 used for microfluidic control
NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) DigiKey.com 2N6427GOS-ND used for microfluidic control
10kOhm, carbon film resistor, 0.25W DigiKey.com P10KBACT-ND used for microfluidic control
Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% DigiKey.com 478-1841-ND used for microfluidic control
Andor CCD camera Andor Zyla 4.2 Plus SCMOS used for microfluidic on chip imaging
ELISA plate reader
two component Silicone  Momentive RTV 615 used for microfluidic chip fabrication
SU-8 photoresist Micrchem SU8 2015 used for microfluidic chip fabrication
AZ4620 photoresist Clariant AZ 4620 used for microfluidic chip fabrication
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC 32G used for microfluidic chip fabrication
20 Gauge Syringe Needle BD used for microfluidic chip fabrication
Labcycler Sensoquest Labcycler PCR 
DNA polymerase Toyobo KDO Plus PCR amplification
Trimethoprim Sigma
Plate reader Biotek Synergy H1 hybrid  antibiotic resistane measurement

Referências

  1. Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
  2. Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
  3. Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution – principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
  4. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
  5. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
  6. Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
  7. Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
  8. Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
  9. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  10. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  11. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  12. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
  13. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
  14. Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
  15. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  16. Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. . Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
  17. Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
  18. Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. . Digital image using Matlab processing. , (2004).
  19. Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
  20. Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
  21. Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
  22. Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
  23. Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
  24. Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
  25. Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
  26. Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
  27. Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).

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Liu, P. C., Lee, Y. T., Wang, C. Y., Yang, Y. Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection. J. Vis. Exp. (115), e54426, doi:10.3791/54426 (2016).

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