Summary

تصميم واستخدام ومنخفضة التكلفة، الآلي Morbidostat عن التكيف تطور البكتيريا تحت المضادات الحيوية اختيار الدواء

Published: September 27, 2016
doi:

Summary

We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

Abstract

نحن تصف منخفضة التكلفة، morbidostat شكلي لوصف المسار التطوري للمقاومة المضادات الحيوية. وmorbidostat هو جهاز ثقافة البكتيرية التي تراقب باستمرار نمو البكتيريا وضبط تركيز الدواء للطعن في البكتيريا باستمرار لأنها تتطور لاكتساب المقاومة للأدوية بشكل حيوي. ويتميز الجهاز بحجم العمل ~ 10 مل ومؤتمتة بالكامل ومجهزة قياس الكثافة الضوئية والمضخات الصغيرة المتوسطة وتسليم المخدرات. للتحقق من صحة منصة، قمنا بقياس الاستحواذ التدريجي من المقاومة ميثوبريم في القولونية MG 1655، ودمج الجهاز مع منصة ميكروفلويديك المضاعفة للتحقيق في مورفولوجيا الخلايا والتعرض للمضادات الحيوية. النهج يمكن أن تصل إلى تحجيم الدراسات المختبرية من مقاومة الجراثيم للأدوية المضادات الحيوية، وهو للتمديد لالتكييفية تطور لتحسين السلالة في الهندسة الأيضية وغيرها من تجارب زراعة البكتيرية.

Introduction

منذ إدخال أول البنسلين المخدرات المضادات الحيوية، وقد وضعت المقاومة للمضادات الحيوية الميكروبية إلى مشكلة صحية عالمية 1. على الرغم من أن اكتساب مقاومة للمضادات الحيوية يمكن دراستها بأثر رجعي في الجسم الحي، وغالبا ما لا تسيطر على ظروف هذه التجارب في جميع أنحاء تطور كامل 2. بدلا من ذلك، يمكن أن تطور مختبر التكيف تكشف عن التطور الجزيئي من الأنواع الميكروبية في ظل الضغوط البيئية أو ضغط اختيار من الدواء المضاد 3. في الآونة الأخيرة، وإجمال العديد من التجارب التطورية تسيطر عليها بشكل جيد لمقاومة المضادات الحيوية في ظهور مقاومة الجراثيم للأدوية المضادات الحيوية. على سبيل المثال، أظهرت مجموعة أوستن الظهور السريع في ميكروفلويديك هندسيا بشكل صحيح بيئة compartmented 4. وmorbidostat وضعت مؤخرا يدفع الطفرات منتظمة تحت المخدرات اختيار ضغط 5،6. وmorbidostat، وSELEC الميكروبيجهاز نشوئها باستمرار على تعديل نسبة تركيز المضادات الحيوية للحفاظ على عدد السكان ثابتا تقريبا، يمثل تقدما كبيرا من الاختبار تذبذب المستخدمة في علم الأحياء المجهرية 7،8. في اختبار التذبذب، يتم حقن الدواء المضاد في تركيز عال، ويتم فحص المسوخ على قيد الحياة وفرزها. بدلا من ذلك، الميكروبات في morbidostat وتحدى باستمرار، والحصول على طفرات متعددة.

وmorbidostat تعمل على غرار ناظم كيميائي، جهاز الثقافة التي اخترعها نوفيك وSzliard في عام 1950 التي تحافظ على السكان المستمر من خلال توفير المواد الغذائية بشكل مستمر في حين تمييع الميكروبي السكان 9. منذ بدء العمل به، وقد تقدمت وناظم كيميائي وتحسينها. وقد وصلت chemostats ميكروفلويديك الحالية نانولتر وحيدة الخلية القدرات. ومع ذلك، وهذه الأجهزة هي غير صالحة للتجارب التطور على التكيف، والتي تتطلب السكان خلية كبيرة مع العديد من الأحداث طفرة 10،11. في الآونة الأخيرة، مصغرةكما تم تطوير chemostats مع وحدات التخزين عمل ~ 10 مل لملء الفجوة بين المفاعلات الحيوية على نطاق ولتر وميكروفلويديك ناظم كيميائي 12،13.

هنا نقدم تصميم واستخدام منخفضة التكلفة، morbidostat الآلي لدراسة مقاومة المضادات الحيوية. وحدة المقترحة يمكن استخدامها في حاضنة شاكر في مختبر علم الأحياء المجهرية مع متطلبات الأجهزة الحد الأدنى. وأيضا مصممة الثابتة المصدر المفتوح بسهولة إلى تطبيقات محددة من تطور على التكيف، مثل الهندسة الأيضية 3. وأخيرا، تم دمج morbidostat إلى منصة ميكروفلويديك المضاعفة لاختبار الحساسية للمضادات الحيوية 14.

Protocol

الجمعية 1. والاختبار التمهيدي للجهاز Morbidostat جمعية Morbidostat لكمة 3 ثقوب على الغطاء من القارورة الثقافة مع حقنة إبرة 18 G. قطع ثلاث قطع من أنابيب البولي ايثيلين ~ 7 سم في الطول. إ…

Representative Results

وschematized وmorbidostat أعلاه هو موضح في الشكل 1. لعمليات morbidostat المشتركة، بما في ذلك التطور التجريبي، اختبار الحساسية للمضادات الحيوية وفحص الخلايا التشكل، والتحقق من صحتها في E. ثقافة القولونية MG1655 تتعرض لميثوبريم (TMP)، وهي تستخدم عادة ال…

Discussion

وأظهر الجهاز morbidostat البصمة المنخفضة من مكونات منخفضة التكلفة. الزيادات في مستوى مقاومة الجراثيم للأدوية المسجلة من قبل الجهاز متوافقة مع تلك التقارير السابقة 5. مصممة للدراسات التطورية للمقاومة المخدرات، والجهاز هو الواجب التطبيق المحتمل لكثير من التجارب الأ…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.

Materials

Environmental Shaker Incubator BioSan ES-20
Arduino Leonardo board Arduino Leonardo
680 Ohm Carbon Resistor Digikey Bias resistor for LED
100k Ohm Carbon resistor Digikey Bias resistor for phototransistor
940 nm light emitting diode Bright LED Electronic BIR-BM13E4G-2 Optical density measurement
940 nm phototransistor Kodenshi  ST-2L2B Optical density measurement
Darlington pair IC Toshiba Mouser ULN2803APG  this IC drives micropumps and magnetic stirring unit
5V DC brushless fan  ADDA AD0405LX-G70 spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com
Piezoelectric micropump CurieJet PS15I-FT-5L Pressure >3kPa  Flow rate >5 ml/min
Tygon 3350 Tuning Saint Gobain ABW00001 ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
Magnetic Stir bar COWIE tapered shape dim: 10 mm x 4mm
Glass scintillation 20ml vial DGS Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h)
Culture vial holder Custom made from Polyformaldehyde 
Silicone  Dow Corning Sylgald 184 used to seal the glass vial
Medium bottle VWR 66022-065
Difco M9 minimal salt 5x BD Medium
Cadamino Acid BD Medium
glucose Sigma
Agar Bateriological Oxoid for agar plate
Luria Bertani medium
Inverted microscope Leica Microsystems Leica DMI-LED used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55
Microscope Incubator Live Cell Instrument CU-109 used for microfluidic measurement
Solenoidal valves Pneumadyne S10MM-31-12-3 Normally open 1.3 Watt 12 Vdc
USB interface card Hobby Engineering USBIO24-R Digital I/O Module  for microfluidics measurement
Air compressor Rocker Scientific ROCKER 440 Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi
Male luer-lock fittings to 1/8" barb ValuePlastics.com MTLL230-1 used for microfluidic control
1/8" barb to 10-32 threaded port ValuePlastics.com B-1 used for microfluidic control
Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port ValuePlastics.com KFTL-1 used for microfluidic control
NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) DigiKey.com 2N6427GOS-ND used for microfluidic control
10kOhm, carbon film resistor, 0.25W DigiKey.com P10KBACT-ND used for microfluidic control
Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% DigiKey.com 478-1841-ND used for microfluidic control
Andor CCD camera Andor Zyla 4.2 Plus SCMOS used for microfluidic on chip imaging
ELISA plate reader
two component Silicone  Momentive RTV 615 used for microfluidic chip fabrication
SU-8 photoresist Micrchem SU8 2015 used for microfluidic chip fabrication
AZ4620 photoresist Clariant AZ 4620 used for microfluidic chip fabrication
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC 32G used for microfluidic chip fabrication
20 Gauge Syringe Needle BD used for microfluidic chip fabrication
Labcycler Sensoquest Labcycler PCR 
DNA polymerase Toyobo KDO Plus PCR amplification
Trimethoprim Sigma
Plate reader Biotek Synergy H1 hybrid  antibiotic resistane measurement

Referências

  1. Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
  2. Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
  3. Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution – principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
  4. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
  5. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
  6. Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
  7. Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
  8. Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
  9. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  10. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  11. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  12. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
  13. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
  14. Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
  15. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  16. Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. . Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
  17. Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
  18. Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. . Digital image using Matlab processing. , (2004).
  19. Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
  20. Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
  21. Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
  22. Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
  23. Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
  24. Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
  25. Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
  26. Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
  27. Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).

Play Video

Citar este artigo
Liu, P. C., Lee, Y. T., Wang, C. Y., Yang, Y. Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection. J. Vis. Exp. (115), e54426, doi:10.3791/54426 (2016).

View Video