sıvı içinde nematod yüzme davranış bilgisayar tabanlı analiz için etkin ve basit bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem C. elegans laboratuarlar için hiçbir yatırım çok az gerektirir. kullanılan donanım standart ve davranışsal analizi (Celest) için bilgisayar yazılımı açık kaynak kodlu bir tanesidir.
davranışı düzenleyen nöronal ve nöromüsküler devreleri Kesme biyoloji önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Nematod Caenorhabditis elegans aslında temel fonksiyonel desen spesifik moleküler sürücüleri aydınlatan, insan beyninin connectome bina, teknolojik yaklaşımlar ilham verici, bu meydan mücadele için yardımcı paha biçilmez bir model organizmadır olduğu kanıtlanmıştır. C. elegans davranışsal çalışmalar dökme katı substratlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. sıvı içinde, hayvanlar 3D hızları aralığında hareket yanı sıra kantitatif için yeni zorluklar tanıtmak gibi ön şekil değişikliği olmadan posterior kıvrılma gibi kısmi vücut hareketleri, dahil davranış sergilerler. Basit bir işlem aşamaları ve C. elegans yüksek çözünürlüklü analiz davranışını yüzmek sağlayan bir yazılımın kullanımı, burada sunulmuştur. Celest adlı yazılım, izleyen bir uzman bilgisayar programı kullananC. birden aynı anda hayvanlar ve sağlayan yeni önlemler sıvı (yüzme) 'de lokomosyon elegans. önlemler çoğunlukla eşik kesilmelerine karşı hesaplama gereksinimleri olmadan, bilgisayar vizyonu ve örüntü tanıma kullanılan matematik hayvan duruş topraklı ve dayanır. Her iki kombine küçük parti çalışmalardan elde edilen hayvanların yüzlerce genel yüzme cesaret değerlendirmek ve hatta yeni fenotipleri iyi karakterize genetik mutantlar ortaya çıkarmak için yazılım aracı kullanılabilir. Celest ile analiz için örneklerin hazırlanması bilimsel topluluk tarafından geniş adaptasyonunu sağlayarak, basit ve düşük teknoloji olduğunu. Burada açıklanan hesaplama yaklaşımının kullanılması dolayısıyla C. elegans modeli davranış ve davranış devrelerin daha iyi anlaşılması için katkıda bulunmalıdır.
genetik, epigenetik, deneyim ve çevre etkisi davranışı modern biyolojinin önemli bir sorundur nasıl tanımlanması. hesaplama izlenen ve bu hedefe doğru kritik katkılar sağlayabilir ölçülebilir Basit, genetik müsait modelleri. Nematod Caenorhabditis elegans böyle bir modeldir. Bu makalenin amacı, lokomosyon yüzme C. elegans izlenir ve biyolojik alaka ile sekiz yeni özellikleri hakkında bilgi ayıklamak için oranlamr nasıl göstermektir.
3 w ve 20 ° C 1,2 yaklaşık 4 gün bir üreme dönemi – C. elegans yaklaşık 2 nispeten kısa bir ömrü vardır. Standart laboratuvar kültürlerde, bu mikroskobik nematod bakteriyel bir besin kaynağı 3,4 ile yayılır nematodu Büyüme Medya (NGM) içeren Petri kapları yetiştirilir. WT N2 hayvanlar agar dolu plakaları üzerinde zarif sinüzoidal dalgalar aktif hareket; Onlar hareket sıçan değiştirmek(tarama) konut, (gıda arayışı) dolaşım, ya da bir yemek (inaktif tokluk sakinleştikten) kurtarma sırasında es 5. Düşüş 6 veya yaş 7-12 zamanda dramatik plakalar üzerinde hareket değiştirebilir.
Healthspan'in ya da yaşlanma davranışı modüle eden genler işlevsel olarak C. elegans hareket paternleri veya lokomosyon analizi ile karakterize edilebilir. Healthspan'in ölçmek için bir yaklaşım olarak şiddetli fiziksel aktivite sınıfı A ve felç olma sınıfının C 7,8,13 ile, plakalar üzerinde kendi hareketin göre üç kategoriye (örneğin, A, B, ve C) içine yaşlanma yetişkin sınıflandırmak etmektir. Böyle nitel sıralama fiziksel uygunluk farklılıkları ortaya çıkarmak için yararlı olsa da, kategoriler net sınırlar olmadan geniştir ve dolayısıyla puanlama önyargı deneyci tabidir.
Izci Giderek artan sayıda nesnellik, gelişmişliği yükseltilmiş, ve C analizi hassas hareketini elegansKatı ortam 14-18. Plakalar üzerindeki hareket çok hayvan ortamın katı yüzey ile temas ettiği düzleme sınırlıdır elegans. (C. elegans, birden çok düzlemde elemanların, bir katı yüzey ile temas halinde de vücudun geri kalan kafadan kaldırarak keşif neden olabilir. Bununla birlikte, bu davranış, olağan değildir.), Sıvı yerleştirilmiştir, bu nematod katı yüzeylerdeki hayvanlara kıyasla daha kapsamlı boyutlu hareketi, hız ve hareket derinliği daha geniş bir yelpazede, ve posterior farklı hareket anterior yaşla birlikte artan insidansı özellikleri bir dalgalı hareket, ya da yüzme, başlatır. fiziksel uygunluk ve yeni ortama yanıt hızlı bir analiz olarak, bir deneyci bir sıvı damlası içine tek bir hayvanı yerleştirebilir ve diseksiyon kapsamında vücut kıvıran frekansını puan. Video kayıt yüzme gücü bugünkü ve gelecekteki skorlarının kolaylaştırabilirhayvan. Ancak, manuel yaklaşım atılır olabilir özelliklerin sayısını sınırlar ve tam bir defada bir hayvan puanlama kısıtlıdır.
sıvı içindeki Hareket az katı ortam üzerinde hareketin daha incelenmiştir. Nitekim, sıvı 19-24 yılında lokomosyon ölçmek için laboratuarda uygulanması sağlam ve kolay birkaç yazılım seçenekleri vardır. Yazılım Celest (C. elegans Swim Testi) Hareket 8 doğası ile doğrudan alakalı verileri (eğrilik puanları) teslim kullanımı ve matematiksel temelli önlemlerin sadeliği sunar; (Restif ve ark., 8 özellikleri ve avantajları detaylı tanımı). Dahası, hesaplama analizleri insan gözünün puan için imkansız olan fenotipik özelliklerin açıklanmasını sağlar. İşte, bu analiz yaklaşımının çözünürlüğü örneklemek veri sonraki Celest analizi açıklanmıştır için yüzmek denemeler kayıt protokolü uygulamak için kolay sunulmuş ve.
Bir model sistem olarak C. elegans kullanımı genetik dövülebilirlik, titiz detay açıklamalı deneysel tractability ve anatomi nedeniyle artmaya devam etmektedir. Örneğin, C. elegans hermafrodit nöronal yapısı ve bağlantı açıkça ölçüde belirli davranışlarını kontrol belirli nöronal devrelerin soruşturma kolaylaştırılması, 34-36 dışarı eşleştirilir. 302 nöronlar lokomosyon gibi temel davranış çıkışlara duyusal girdilerin geniş bir işleme yetişkin hermafrodit en sinir sistemini oluşturmaktadır. Daha karmaşık bir erkek sinir sisteminin yapısı da ele alınması cinsiyete özgü devreyi sağlayan, 37 tarif edilmiştir. 37
C. elegans davranışı yoğun katı ortam içeren standart kültür levhaları üzerinde incelenmiştir. WT C, agar dolu plakaları üzerinde öngörülebilir sinüzoidal dalgalar halinde hareket, sapmaları elegans yanagenel model gözü tarafından algılanabilen ve el attı edilebilir. Bu yaklaşım, ancak deneycinin kritere tabi olup emek yoğundur. Izlemek ve C. katı ortam üzerinde lokomosyon ele alınması daha sofistike biyolojik soruları izin, öznellik önyargı kaldırmak ve büyük ölçekli çalışmalar için izin elegans ölçmek için tasarlanmış donanım ve yazılım araçları. Schafer laboratuarında 16 tarafından oluşturulan son davranışsal veritabanı plakaları üzerinde hareket etmek için bir hesaplama sistemi ile elde edilmiştir analitik uzantısı ve derinlik mükemmel bir örnektir.
WT C. elegans sıvı yerleştirildiğinde, hayvan hızla yüzerek başlatarak, yeni ortama hareketini uyarlar. C. yüzme tarama daha hareket daha geniş bir yelpazede kullanır ve 8 daha düzensiz olabilir elegans. Celest gibi yazılım C. detaylı analiz için boşluğu doldurmak için tasarlanmıştır sıvı içinde, Permi davranışı eleganskolayca un destekli gözle ölçülen değil, ya da daha hızlı manuel puanlama daha yapılabilir hareket ilişkili parametrelerin tting kantitatif. 8 sabit h bir birey ~, 200 videoları günde 1000 kayıtları işleme olabilir.
Yazılım fiziksel uygunluk ve davranış kapsamlı bir parmak izi olarak hizmet değerlendiren parametreleri yüzme tanımlar. C. elegans sıvı davranış ve bunların altında yatan moleküler yolların karmaşık yönleriyle anlaşılmasını zenginleştirerek yanı sıra, bu yazılım farmakolojik tepkiler, yaşlanma ve farklı davranış da dahil olmak üzere biyoloji birden yönlerini keşfetmek için kullanılabilir. Bu yaş yazılım gibi uygulamanın bir örnek olarak burada sunulan, C fiziksel performans ortaya sayısal değişikliklerin genel yetişkin elegans (daha ayrıntılı bir açıklama için, Restif ve ark. 8). yaşlanma çerçevede, ölçülen parametreler ise azalmıştırDiğerleri artmış veya sürekli vahşi tip değişmedi. Eğilimler uzun ömürlü mutantlar hesaplama profili ile büyük ölçüde teyit edildi ve aynı yaştaki nüfusun zarif ve kötü ager kohortların göreli profilleri homojen çevre koşullarında tuttu. Yazılımın yüksek çözünürlüklü da kapsamlı bir şekilde, özelliği mutant (Şekil 1 'de, örneğin, yaş-1 (hx546)), daha önce bilinmeyen bir ince fenotipleri ortaya çıkarabilir.
tarif edilen protokolün bir kaç özellikle kritik adım vardır. deneyci son derece tesadüfi sıcaklık değişiklikleri önlemek için büyük ağrıları gitmek için teşvik böylece yüzmek çevre ve gerilme plaka kültürü arasında bir sabit sıcaklık ortamını koruyarak, yüzmek tekrarlanabilir için önemlidir. Yüzücü ortam plakaları ile aynı sıcaklıkta olmalıdır. Aynı şekilde, yüzmek için damla boyutu dikkatli özen tekrarlanabilirliği sağlamaya yardımcı olur. Son olarak, düşünmek ihtiyatlıbirikir büyük video dosyalarını boşaltma konusunda ilerlemek. video yakalama bilgisayardan ayrı bir sitedeki görüntü işleme tavsiye edilir.
yüzmek analiz için burada sunulan yazılımın kullanımı bazı sınırlamalar vardır. programları aynı anda birden fazla hayvan izleyebilirsiniz rağmen beşten fazla hayvan ortaklaşa incelendiğinde ise Birincisi, hayvanlar video görüntüleri birbirlerine yüzerek olacağı artan bir şansı yoktur. Ne zaman programı açıkça bu o veri çerçeveleri censors, hangi hangi hayvan belirleyemiyor. Bu program özelliği, bireysel hayvanlar için veriler yüksek kalitede olmasını sağlar rağmen, verimi sınırlamaktadır. ilişkili sinyaller aynı zamanda görüntü analizleri etkileyebilecek gibi İkincisi, görüntüler oldukça temiz olması gerektiğini, toz, leke ve ışıklar parlama ücretsizdir. protokol Bölüm 2.1.1, büyük ölçüde dalgalanmalar komplikasyonları ortadan kaldırarak görüntü yakalama yardımcı olabilir çok düşük teknolojili yatırım belirtildiği gibi benn çevre aydınlatma ortam ışığı aşamaya ulaşmak için izin vermez bir karanlık bezle sahne alanı kapsayacak etmektir. Üçüncü olarak, program, yetişkin safhasında hayvanlar için optimize edilmiştir. Genç larvalar yüzmek çok hızlı ve program hatası artırır, küçük bedenlere sahip. Dördüncü olarak, bazı yazılım MATLAB kullanır ve sürüm yükseltmeleri ve / veya işletim sistemi yükseltmeleri olduğunda, bazı program bağlantıları bozulabilir. Şu anda, yazılım MATLAB 2015b ve Mac OS sürümü 10.10 kullanım için optimize edilmiş, ama biz yakında bu tür değişikliklere karşı daha dayanıklı bir yazılım sürümünü göndermek için bekliyoruz edilir. Son olarak, video veri dosyaları hızlı geniş olur ve tahsis edilecek depolama alanı gerektirebilir.
Özetle, burada sunulan kolayca Celest analizi için yüzme C. elegans videoları oluşturmak için çok yatırım yapmadan herhangi bir laboratuvar tarafından uygulanan basit bir yöntemdir. yazılım paketinin özellikleri sayesinde izleme kapsamlı otomasyon dahilanalizi, aynı anda birden fazla hayvan izleme ve çoğu lokomosyon parametrelerinin kantitatif için matematiksel üsleri (yani eğrilik tedbirler) kullanımı. Yazılım Restif ark ayrıntılı olarak halka açık kod ve demolar ile açık kaynak vardır. 8. Program takibi için gelişmiş bilgisayar vizyonu analizi, diğer yayınlanmış izleme sistemleri özellikleri olsa da (örneğin, Greenblum ve diğ., 2014 38) Burada sunulan yazılımın parametre analizi ile uyumludur. Gelecek gelişmeler yukarıda belirtilen işletim sistemleri (aynı zamanda Malzemelerin Tabloda belirtilen) özel sürümleri için kullanımını kısıtlamak değil daha sağlam bir paket içine dönüştürme yazılımı doğru yönlendirilecektir.
The authors have nothing to disclose.
NIH tarafından desteklenen Celest geliştirme R21AG027513 ve U01AG045864 verir. Veriler ve bazı kısa video gösterimleri Restif ark uyarlanmıştır. Creative Commons Attribution (CC BY) lisansı http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ altında yayınlandı (2014) 8. Biz el yazması yardım için Ricardo Laranjeiro teşekkür ederiz.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |