의 자동 분석<em> C. 엘레</emCeleST 소프트웨어를 사용> 수영 동작
Summary
액체의 선충 유영의 컴퓨터 기반 분석을위한 효과적이고 간단한 방법을 설명한다. 이 방법은 C. elegans의 실험실에 대한 더 투자에 조금 필요합니다. 사용되는 하드웨어는 표준 및 행동 분석 (CeleST)을위한 컴퓨터 소프트웨어는 오픈 소스이다.
Abstract
행동을 조절하는 신경 세포 및 신경 근육 회로를 해부하는 것은 생물학의 주요 과제 남아있다. 선충 Caenorhabditis 엘레 간스 실제로 기본 기능 패턴의 특정 분자 드라이버에 빛을 발산하기 위해, 인간의 두뇌 커 넥톰을 구축, 기술적 접근 방법을 영감에서이 문제를 해결하는 데있어서 매우 귀중한 모델 생물로 입증되었습니다. 선충의 행동 연구의 대부분은 고체 기판에서 수행되었다. 액체에서, 동물 차원에서 속도의 범위에서 운동뿐만 아니라 정량을위한 새로운 도전을 소개하는 등 전방 형상 변화없이 후방 컬과 같은 부분 신체의 움직임을 포함 할 행동 패턴을 나타낸다. 다음은 간단한 절차의 단계 및 선충의 고해상도 분석이 동작을 수영 할 수있는 소프트웨어의 사용은 여기에 표시됩니다. CeleST라는 이름의이 소프트웨어는, 추적하는 전문 컴퓨터 프로그램을 사용하여C. 여러 동시에 동물과 제공하는 새로운 조치 액체 (수영)에서 운동 엘레 간스. 조치는 대부분 임계 컷 오프에 대한 계산 요구하지 않고, 컴퓨터 비전 및 패턴 인식에 사용되는 수학에 동물 자세에 근거하고 기반으로합니다. 모두 결합 된 작은 배치 시험에서 동물의 수백 전체 수영 솜씨를 평가하고, 심지어에서 새로운 표현형 잘 특징 유전자 돌연변이를 공개 할 수있는 소프트웨어 도구를 사용할 수 있습니다. CeleST와 분석을위한 시료의 준비는 과학계에 의해 넓은 적응을 가능하게, 간단하고 낮은 기술이다. 여기에 설명 된 계산 방법의 사용은 따라서 C. 엘레 모델의 행동과 행동 회로의 더 큰 이해에 기여한다.
Introduction
유전학, 후성 유전학, 경험, 환경 영향 문제는 현대 생물학의 주요 과제가 얼마나 정의. 계산 추적이 목표를 향한 중요한 기여를 할 수 있습니다 측정 할 수있는 간단한 유전자 의무가 모델. 선충 예쁜 꼬마 선충은 하나의 모델입니다. 이 문서의 목적은 운동을 수영 C. elegans의 추적 및 생물학적 관련성 여덟 새로운 기능에 대한 정보를 추출 정량하여 할 수있는 방법을 설명하는 것입니다.
3w 20 ° C 1, 2 약 4 D의 생식주기 – C. elegans의 약 2의 비교적 짧은 수명을 가지고있다. 표준 실험실 문화에서,이 미세한 선충은 세균 음식 소스 3,4로 확산되는 선충 성장 미디어 (NGM)를 포함하는 페트리 접시에 성장한다. WT N2 동물 한천 가득한 접시에 우아한 정현파에 적극적으로 이동; 그들은 이동 쥐를 변경(검색)를 주거, (음식의 추구를) 로밍, 또는 식사 (비활성 포만 정지)에서 복구 할 때 ES 5. 장애 6 세 7 ~ 12도 획기적으로 접시에 운동을 변경할 수 있습니다.
healthspan 노화 동작을 조절 유전자는 기능적 C. elegans의 이동 패턴이나 운동 분석을 특징으로 할 수있다. healthspan를 측정하는 한 가지 방법은 물리적 인 활발한 활동 클래스 A 및 클래스 C 마비되는 7,8,13과, 플레이트에 그 운동에 따른 3 종류 (예를 들어, A, B, 및 C)로 성인 노화를 분류하는 것이다. 이러한 질적 정렬은 체력의 차이를 공개하는 데 유용하지만, 카테고리는 명확한 경계없이 광범위하므로 자신의 점수는 편견을 실험 될 수 있습니다.
추적자의 증가는 객관성, 세련 상승했으며, C의 분석의 정밀도는 움직임을 엘레 간스고체 배지 14-18에. C.는 플레이트에 운동은 주로 동물 매체의 고체 표면과 접촉하는면에 제한 간스. (C. 엘레은 여러면에서 몸의 위치, 고체 표면과 접촉 여전히 신체의 나머지 부분에서 떨어져 머리를 들어 올려 탐사를 유도 할 수있다. 그러나,이 문제가 이례적인 일이다.) 액체에 위치하는 경우,이 선충은 고체 표면에 동물에 비해 더 광범위한 차원의 움직임, 속도, 운동의 깊이의 큰 범위 및 후방 다르게 이동 전방의 연령이 증가 발생률을 갖추고 파동 운동, 수영을 시작합니다. 체력과 새로운 환경에 대한 응답의 빠른 분석 등의 실험은 액체 방울로 개별 동물을 배치 할 수 있습니다 및 해부 범위에 몸 벤드 주파수 점수. 비디오 녹화가의 수영 활력의 현재와 미래 스코어링을 용이하게 할 수있다동물. 그러나, 수동 방식은 획득 될 수있는 기능의 수를 제한하고, 완전히 한번에 하나의 동물을 처치하는 데 제한된다.
액체의 운동은 작은 고체 미디어 운동보다 탐구하고있다. 실제로, 액체 19-24에서 운동을 측정하기 위해 실험실에서 구현하는 강력하고 쉬운 몇 가지 소프트웨어 옵션이 있습니다. 소프트웨어 CeleST (C. elegans의 수영 테스트) 모션 (8)의 특성에 직접적으로 관련 데이터 (곡률 점수)를 제공하는 사용과 수학 기반 측정의 단순성을 제공합니다; (Restif 등. 팔의 기능과 장점을 자세히 설명). 또한, 계산 분석은 인간의 눈이 골 불가능하다 표현형 기능의 해명을 가능하게한다. 여기서,이 분석 방법의 해상도를 예시 데이터는 후속 CeleST 분석 설명을 위해 수영 시험을 기록하기 위해 프로토콜을 구현하기 쉽게 제시하고있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모델 시스템으로 C. 엘레 간스의 사용은 유전 전성, 세심한 세부 사항에 주석 실험 취급 용이성 및 해부학으로 인해 증가하고 있습니다. 예를 들어, 선충의 자웅 동체의 신경 구조와 연결이 명확 크게 특정 동작을 제어 특정 신경 회로의 연구를 촉진, 34-36을 매핑됩니다. 302 운동 뉴런 같은 기본 행동 출력으로 감각 입력 광범위한 처리 성숙한 자웅 동체의 신경계를 구성한다. 더 복잡한 남성 신경계 구조는 해결 될 성 특정 회로를 활성화 37 설명되었다. (37)
C. elegans의 동작은 광범위하게 고체 배지를 포함하는 표준 배양 플레이트에 연구되고있다. WT C.는에서 한천 가득한 접시에 예측 정현파으로 이동, 편차 엘레 간스 때문에전체 패턴은 눈으로 감지 수동으로 획득 할 수있다. 이 방법은, 그러나, 실험의 기준을 준수하고 노동 집약적이다. 추적 C. 고체 미디어 운동이 해결해야하는보다 정교한 생물학적 질문을 허용, 주관 바이어스를 제거하고 대규모 연구를 허용 엘레 간스 측정하기위한 하드웨어 및 소프트웨어 도구를 제공합니다. 쉐퍼 연구소 (16)에 의해 생성 된 최근의 행동 데이터베이스는 접시에 운동을위한 전산 시스템으로 달성 된 분석 확장과 깊이의 훌륭한 예입니다.
WT C. elegans의 액체에 배치되는 경우, 동물은 신속하게 수영을 개시하는 새로운 환경으로의 이동을 적응시킨다. C. 수영 크롤링보다 운동의 큰 범위를 활용하여 8 개의 불규칙 할 수 있습니다 엘레 간스. CeleST 같은 소프트웨어가 C의 상세한 분석을위한 갭을 채울 목적으로하는 액체, permi 동작을 엘레 간스쉽게되지 않은 도움을 눈으로 측정되지 않는, 또는 더 빠르게 수동 득점 이상 수행 할 수 있습니다 운동 관련 매개 변수의 tting 정량. 8 하드 시간에서 개인은 ~, (200) 동영상에 하루에 1,000 레코드를 처리 할 수 있습니다.
이 소프트웨어는 체력과 행동의 포괄적 인 지문의 역할을 평가하는 매개 변수를 수영 정의합니다. C. elegans의 액 동작 및 기본 분자 경로의 복소 패싯 이해 농축 이외에,이 소프트웨어는 약리학 적 반응, 노화, 별개의 동작을 포함한 생물학의 여러 측면을 탐색 할 수있다. 그들은 시대의 소프트웨어와 같은 응용 프로그램의 한 예입니다 여기 발표, C.의 물리적 성능에서 발생하는 정량 변화의 개요 성인 엘레 간스 (더 자세한 계정, Restif 등. 8 참조). 노화의 맥락에서, 일부 측정 파라미터하면서 거절다른 사람은 증가 또는 지속적으로 야생형에 변화가 없었다. 동향 장수 돌연변이의 계산 프로파일에 의해 상당 부분 확인하고, 동일 연령 인구의 우아하고 나쁜 어른의 동료의 상대 프로필은 균일 한 환경 조건을 유지하고 있습니다. 소프트웨어의 높은 해상도는 광범위 특징 돌연변이 (그림 1의 예를 들면, 연령-1 (hx546)) 이전에 알 수없는 미묘한 표현형을 표시 할 수 있습니다.
기술 된 프로토콜의 몇 특히 중요한 단계가 있습니다. 실험자가 높은 임의의 온도 변화를 피하기 위해 큰 고통으로 이동하는 것이 좋습니다 그래서 수영 환경과 변형 판 문화 사이의 일정한 온도 환경을 유지하는 것은, 수영 재현성이 중요하다. 수영 미디어는 판과 동일한 온도에서해야합니다. 마찬가지로, 수영의 드롭 크기에 세심한주의가 재현성을 보장하는 데 도움이됩니다. 마지막으로, 생각하는 것이 현명하다누적 큰 비디오 파일의 오프로드에 대한 사전. 비디오 캡처 컴퓨터에서 떨어져 사이트에서 이미지를 처리하는 것이 좋습니다.
수영 분석을 위해 여기에 제시된 소프트웨어의 사용은 특정 제한 사항이 있습니다. 프로그램이 동시에 여러 동물을 추적 할 수 있지만 개 이상 동물을 공동으로 분석 할 경우 먼저, 동물은 비디오 이미지에서 서로간에 수영 것을 증가 된 기회가있다. 때 프로그램이 명확하게는 그 데이터 프레임을 검열하는이었다 동물 확인할 수 없습니다. 이 프로그램 기능은 개별 동물에 대한 데이터는 높은 품질의 보장 있지만 처리량을 제한한다. 관련 신호는 이미지 분석을 혼동 할 수 있습니다 둘째, 이미지가 상당히 깨끗해야, 즉, 먼지, 얼룩 및 조명의 눈부심 무료입니다. 프로토콜 섹션 2.1.1 크게 변동 합병증을 제거하여 이미지 캡처 도움이 될 수 있습니다 매우 낮은 기술 투자에 명시된 바와 같이 전N 환경 조명은 주변 광이 단계에 도달 할 수없는 어두운 천 스테이지 영역을 커버한다. 셋째, 프로그램 단계에서 성인 동물에 최적화되어있다. 젊은 유생 수영 매우 빠르고 프로그램 오류를 증가시키는 작은 몸을 가지고있다. 넷째, 소프트웨어의 일부는 MATLAB 활용 및 버전 업그레이드 및 / 또는 운영 체제 업그레이드가있는 경우, 어떤 프로그램 링크가 중단 될 수있다. 현재, 소프트웨어는 MATLAB의 2015b 및 Mac OS 버전 10.10에서 사용하기에 최적화 된,하지만 우리는 곧 이러한 변화에 대해보다 강력한있는 소프트웨어 버전을 게시 할 것으로 예상된다. 마지막으로, 영상 데이터 파일은 빠르고 커질 및 할당 할 저장 공간을 필요로 할 수있다.
요약하면, 여기에 제시된 쉽게 CeleST 분석을 위해 수영 C. elegans의 동영상을 만들기 위해 많은 투자없이 실험실에 의해 구현 될 수있는 간단한 방법입니다. 소프트웨어 패키지의 기능을 통해 추적에서 광범위한 자동화를 포함분석, 동시 다중 동물 추적, 대부분의 운동 매개 변수의 정량을위한 수학적 기초 (즉, 곡률 측정)의 사용. 이 소프트웨어는 Restif 등에 설명 된대로 공개 코드와 데모와 오픈 소스입니다. 8. 프로그램 추적 고급 컴퓨터 비젼 분석, 다른 문서 추적 시스템을 갖추고 있지만 (예 Greenblum 외., 2014 (38))은 여기에 제시된 소프트웨어의 매개 변수 분석과 호환된다. 미래의 향상 상술 한 운영 체제 (또한 재료의 표에 나타난)의 특정 버전의 사용을 제한하지 않는보다 견고한 패키지로 변환 소프트웨어 향하는 것이다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH에 의해 지원되었다 CeleST 개발 R21AG027513과 U01AG045864을 부여합니다. 데이터 및 일부 짧은 영상 표현이 Restif 등의 알에서 적응하고 있습니다. 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 (CC BY) 라이센스 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/로 출판되었다 (2014) 8. 우리는 원고 도움 리카르도에서 Laranjeiro 감사합니다.
Materials
| REAGENT | |||
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
| OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
| Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
| EQUIPMENT | |||
| CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
| MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
| Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
| Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
| Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |
Referências
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