Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto
Summary
Os macrófagos são células plasmáticas do sistema hematopoiético que desempenham um papel crucial na imunidade protetora e na homeostase. Neste relatório , descrevemos técnicas otimizadas in vitro para caracterizar fenotípica e funcionalmente macrófagos reguladores infiltrantes de enxerto que se acumulam no órgão transplantado em condições tolerogênicas.
Abstract
A acumulação de macrófagos em órgãos transplantados tem sido reconhecida como uma característica da rejeição de aloenxerto 1 . Os monócitos imunogênicos infiltram o aloenxerto logo após o transplante, montam uma resposta reativa do enxerto contra o órgão transplantado e iniciam a rejeição dos órgãos 2 . Dados recentes sugerem que os macrófagos supressivos facilitam o transplante de longo prazo com êxito 3 e são necessários para a indução de tolerância ao transplante 4 . Isso sugere um conceito multidimensional de ontogenia, ativação e função de macrófagos, que exige um novo roteiro para isolamento e análise da função de macrófagos 5 . Devido à plasticidade dos macrófagos, é necessário fornecer uma metodologia para isolar e caracterizar macrófagos, dependendo do ambiente de tecido, e definir suas funções de acordo com diferentes cenários. Aqui, nós descrevemosSeja um protocolo para a caracterização imune de macrófagos infiltrados por enxerto e os métodos que usamos para avaliar funcionalmente sua capacidade de inibir a proliferação de CD8 + T e promover a expansão de Treg de CD4 + Foxp3 + in vitro .
Introduction
Este protocolo descreve técnicas in vitro para estudar a função de macrófagos infiltrantes de tecidos isolados de aloenxertos cardíacos, de acordo com sua capacidade de modular as respostas de células T. Amplamente descritos na literatura, corantes de rastreamento de células fluorescentes em combinação com citometria de fluxo, são ferramentas poderosas para estudar a função supressiva de tipos celulares específicos in vitro e in vivo. Nosso protocolo segue o método do éster de succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos in vitro .
Quando uma célula marcada com CFSE se divide, sua progênie adquire metade do número de moléculas marcadas com carboxifluoresceína 6 . A diminuição correspondente na fluorescência celular por citometria de fluxo pode ser usada para avaliar a divisão celular, monitorando a capacidade de macrófagos supressivos para modular as respostas imunes das células T. Como o CFSE é um corante à base de fluoresceína, é compatível com um brGama de outros fluorocromos, tornando-o aplicável à citometria de fluxo multicolorida. A escolha apropriada de fluorocromos para fenotípulos também é importante para evitar a sobreposição espectral excessiva e a incapacidade de reconhecer células positivas a anticorpos, particularmente com corantes proteicos visíveis, como o CFSE 7 .
Existem muitas vantagens de usar corantes fluorescentes em técnicas alternativas que medem a proliferação celular, como o ensaio de incorporação de timidina, que usa a timidina radiomarcada (TdR) 8 . Este ensaio utiliza timidina tritiada (3H-TdR) que é incorporada em novas cadeias de DNA cromossómico durante a divisão de células mitóticas. Uma preocupação de segurança associada a este ensaio é o uso de radioisótopos, uma vez que um contador beta de cintilação é usado para medir a radioatividade no DNA recuperado das células para determinar a extensão da divisão celular. Metodologicamente, o burro de timidina tritiadoAy não é flexível o suficiente para se adequar às importantes restrições de laboratório clínico, como o baixo número de células e a análise tardia após a coloração. Pelo contrário, a coloração com CFSE demonstrou prevenir a proliferação celular e interferir com marcadores críticos de ativação, como CD69, HLA-DR e CD25 9 . Portanto, a compreensão de vantagens e limitações de cada metodologia, particularmente em estudos multicoloridos, onde corantes múltiplos são usados para rastrear diferentes tipos de células, é fundamental para obter resultados precisos e reprodutíveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve os métodos que usamos para imuno-caracterizar subconjuntos de células mieloides infiltradas por enxerto em um modelo experimental murino de transplante cardíaco, que também é aplicável a outros tecidos em diferentes modelos experimentais murinos. A classificação de células de baixa pressão a 20 psi foi o método preferido para isolar um bom rendimento de subconjuntos de células puras. Manter a pureza de cada subconjunto mielóide é fundamental para estabelecer resultados conclusivos d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos as contribuições técnicas dos Centros de Citometria de Fluxo, Microcirurgia e Biopositório / Patologia de Excelência em Pesquisa no Monte Sinai. Este trabalho foi apoiado pela Ação COST BM1305: Ação para Focar e Acelerar Terapêuticas Tolerogênicas Celulares (A FACTT), os fundos de desenvolvimento do Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministério da Ciência e Inovação SAF2013-48834-R e SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Referências
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