אפיון פונקציונלי של מקרופאגים רגולטוריים המעכבים חסינות-תגובתי חסינות
Summary
מקרופאגים הם תאי פלסטיק של מערכת hematopoietic כי יש תפקיד מכריע בחסינות מגן הומיאוסטזיס. בדו"ח זה, אנו מתארים אופטימיזציה של טכניקות חוץ גופית כדי phenotypically ופונקציונלית לאפיין להשתלשלים מסתננים מקרופאגים תקינה המצטברים באיבר המושתל בתנאים סובלני.
Abstract
הצטברות מקרופאג באיברים המושתלים הוכרה מזה זמן רב כתכונה של דחיית אלוגראפט. מונוציטים אימונוגניים לחדור את האלוגראפט מוקדם לאחר ההשתלה, לעלות תגובה תגובתית שתל נגד האיברים המושתלים, וליזום דחייה איברים 2 . נתונים אחרונים מראים כי מקרופאגים מדכאים להקל על השתלות לטווח ארוך מוצלח 3 נדרשים לגירוי של השתלות השתלות 4 . דבר זה מצביע על תפיסה רב-ממדית של אוקטוגני מקרופאג, הפעלה ותפקוד, הדורשת מפת דרכים חדשה לבידוד וניתוח של מקרופאג ' 5 . בשל הפלסטיות של מקרופאגים, יש צורך במתודולוגיה לבודד ולאפיין מקרופאגים, בהתאם לסביבה רקמות, ולהגדיר את הפונקציות שלהם על פי תרחישים שונים. הנה, אנחנו descriלהיות פרוטוקול אפיון החיסון של מקרופאגים השתל השתוללות ושיטות נהגנו להעריך פונקציונלית יכולתם לעכב התפשטות CD8 + T ו לקדם CD4 + Foxp3 + הרחבת Treg במבחנה .
Introduction
פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית ללמוד את הפונקציה של מקרופאגים מסתננים רקמות מבודד allografts לב, על פי יכולתם לווסת תגובות תא T. תיאורים נרחבים בספרות, צבעים ניטור פלורסנט תא בשילוב עם cytometry זרימה, הם כלים רבי עוצמה כדי ללמוד את הפונקציה המדכאת של סוגי תאים ספציפיים במבחנה in vivo. פרוטוקול שלנו עוקב אחר השיטה carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) לניטור התפשטות לימפוציטים במבחנה .
כאשר תא CFSE שכותרתו מחלק, צאצאיה רוכש חצי מספר של carboxyfluorescein מתויגות מולקולות 6 . הירידה המקבילה פלואורסצנטי התא על ידי cytometry הזרימה ניתן להשתמש כדי להעריך את חלוקת התא, ניטור היכולת של מקרופאגים מדכאים כדי לווסת את התגובה החיסונית של תאי T. מאז CFSE הוא צבע פלואורסצנטי מבוסס, הוא תואם עם brOad טווח של fluorochromes אחרים, מה שהופך אותו ישים cytometry זרימה רב צבע. הבחירה הנכונה של fluorochromes פנוטיפינג חשוב גם כדי למנוע חפיפה ספקטרלית מוגזמת וחוסר היכולת לזהות תאים חיוביים נוגדנים, במיוחד עם צבעים חלבונים גלויים כגון CFSE 7 .
ישנם יתרונות רבים של שימוש בצבעי פלואורסצנט על טכניקות חלופיות למדידת התפשטות תאים, כגון assay שילוב thymidine, אשר משתמשת thymidine radiolabeled (TdR) 8 . Assay זה מנצל thymidine tritiated ( 3 H-TdR), כי הוא משולב לתוך גדילים חדשים של DNA כרומוזומלי במהלך חלוקת התא מיטוטי. דאגה בטיחותית הקשורה assay זה הוא השימוש רדיואיזוטופים, שכן ניטור ביתא scintillation משמש למדידת רדיואקטיביות ב- DNA התאושש מן התאים על מנת לקבוע את מידת חלוקת התא. מתודולוגית, התחת thymidine tritiatedאי הוא לא מספיק גמיש כדי להתאים את האילוצים המעבדה קליניים חשובים כגון מספר נמוך של תאים וניתוח מושהה לאחר מכתים. להיפך, מכתים CFSE הוכח כדי למנוע התפשטות תאים ולהפריע סמנים הפעלה קריטית, כגון CD69, HLA-DR ו CD25 9 . לכן, הבנת היתרונות והמגבלות של כל מתודולוגיה, במיוחד במחקרים רב צבעוניים שבהם צבעים מרובים משמשים כדי לעקוב אחר סוגי תאים שונים, הוא קריטי להשגת תוצאות מדויקות לשחזור.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השיטות נהגנו immunocharacterize השתל-חדירה תת תא מיאלואידי במודל Murine ניסיוני של השתלת לב, אשר חל גם על רקמות אחרות מודלים שונים ניסיוני Murine. תאים בלחץ נמוך מיון ב 20 psi היתה השיטה המועדפת לבודד תשואה טובה של תת תאים טהורים. שמירה על טוהר של כל תת משנה מיאלואיד?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את התרומות הטכניות של Cytometry זרימה, Microsurgery, ו Bio-מאגר / פתולוגיה מרכזי מצוינות מחקר בהר סיני. עבודה זו נתמכה על ידי פעולה CO1 BM1305: פעולה להתמקד ולהאיץ תא Cellerogenic טיפולים (FACTT), הר סיני Recanati / מילר השתלות קרנות ההתפתחות, שר הבריאות של Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R ו SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Referências
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2’deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238 (2007).
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
