이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명
Summary
대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.
Abstract
이식 장기의 대 식세포 축적은 동종 이식 거부 1 의 특징으로 오래 동안 인식되어왔다. 면역 원성 단핵구는 이식 후 조기에 동종 이식종에 침투하고, 이식 장기에 대한 이식편 반응 반응을 일으키며 장기 거부 반응을 시작합니다 2 . 최근 데이터는 억제 성 대 식세포가 장기 이식 성공을 촉진하고 이식 내성의 유도에 필요하다는 것을 시사한다. 이것은 macrophage 기능의 분리 및 분석을위한 새로운 로드맵을 요구하는 macrophage ontogeny, activation 및 function의 다차원 개념을 제안합니다. 대 식세포의 소성 때문에 조직 환경에 따라 대 식세포를 분리하고 특성화하는 방법론을 제공하고 여러 시나리오에 따라 기능을 정의해야합니다. 여기, 우리는 descri이식편 침윤성 대 식세포의 면역 특성 규명 및 우리가 기능적으로 CD8 + T 증식을 억제 하고 체외에서 CD4 + Foxp3 + Treg 확장을 촉진시키는 능력을 기능적으로 평가하는 데 사용한 방법이 될 수 있습니다.
Introduction
이 프로토콜은 T 세포 반응을 조절하는 능력에 따라 심장 동종 이식으로부터 격리 된 조직 침윤성 대 식세포의 기능을 연구하기위한 시험 관내 기술을 기술한다. 문헌에 널리 기술되어 있듯이, 형광 세포 추적 염료는 유세포 분석과 함께 체외 및 특정 생체 내 특정 세포 유형 의 억제 기능을 연구하는 강력한 도구 입니다. 우리의 프로토콜 은 체외에서 림프구 증식을 모니터링하기 위해 carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 방법을 따른다.
CFSE로 표지 된 세포가 분열하면 그 자손은 카르복시 플루 오레 신 표지 분자의 수의 절반을 얻습니다. 유동 세포 계측법에 의한 세포 형광의 감소는 T 세포 면역 반응을 조절하는 억제 성 대 식세포의 능력을 모니터링하는 세포 분열을 평가하는데 사용될 수있다. CFSE는 플루 오레 신계 염료이기 때문에 br다량의 유동 세포 계측법에 적용 할 수있는 다른 형광 크로마토 그래피의 범위를 제공합니다. phenotyping을위한 fluorochromes의 적절한 선택은 과도한 스펙트럼의 중복과 항원 양성 세포, 특히 CFSE 7 와 같은 가시 단백질 염료를 인식하지 못하는 것을 피하기 위해서도 중요합니다.
방사성 표지 된 티미 딘 (TdR) 8 을 사용하는 티미 딘 도입 분석과 같은 세포 증식을 측정하는 대체 기술에 비해 형광 염료를 사용하면 많은 이점이 있습니다. 이 분석은 mitotic 세포 분열 동안 염색체 DNA의 새로운 가닥에 통합되는 삼중 티미 딘 ( 3 H-TdR)을 이용한다. 이 분석과 관련된 안전 문제는 방사성 동위 원소의 사용이다. 왜냐하면 신틸레이션 베타 계수기가 세포 분열 정도를 결정하기 위해 세포에서 회수 된 DNA의 방사능을 측정하기 때문이다. 방법 론적으로, 삼중 수소 티미 딘 엉덩이ay는 세포 수가 적고 염색 후 지연된 분석과 같은 중요한 임상 실험실 제약 조건에 맞을만큼 유연하지 않습니다. 반대로, CFSE 염색은 세포 증식을 예방하고 CD69, HLA-DR 및 CD25와 같은 중요한 활성화 마커를 방해하는 것으로 나타났습니다. 따라서 각 방법론의 장점과 한계를 이해하는 것은 특히 여러 염료를 사용하여 여러 세포 유형을 추적하는 다색 연구에서 정확하고 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 심장 이식의 실험 쥐 모델에서 이식편 – 침윤 골수 세포 서브 세트를 면역화하는 데 사용한 방법을 기술하며, 이는 다른 쥐 실험 모델의 다른 조직에도 적용 가능합니다. 20 psi에서의 저압 셀 분류는 순수한 셀 하위 집합의 좋은 수율을 격리하는 데 선호되는 방법이었습니다. 각 골수 하위 집합의 순도를 유지하는 것은 다른 골수 집단 사이의 억제 능력의 결정적인 결과를 확립하는 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Sinai 산에서의 연구 우수성의 Flow Cytometry, Microsurgery 및 Bio-repository / Pathology Centres의 기술적 인 공헌을 인정합니다. 이 연구는 COST Action BM1305의 지원을 받았다. Salli Mount Recanati / Miller Transplantation Institute 발달 기금, Ciencia e Innovacion Minister SAF2013-48834-R 및 SAF2016-80031-R에 초점을 맞추고 세포 독감 치료법 (A FACTT)을 가속화하는 활동 조
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Referências
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