An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Toutes les procédures de séquençage de nouvelle génération (NGS) comprennent des analyses effectuées sur le banc de laboratoire ( «banc humide») et les données analyses effectuées en utilisant la bioinformatique pipelines ( «banc sec»). Les deux éléments sont essentiels pour produire des résultats précis et fiables, qui sont particulièrement critiques pour les laboratoires cliniques. technologies NGS ciblées ont de plus en plus trouvé grâce à des applications en oncologie pour aider les objectifs de la médecine de précision avance, mais les méthodes impliquent souvent déconnecté et variable workflows banc humides et secs et des ensembles de réactifs non coordonnées. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour le séquençage contestant spécimens de cancer avec un panel de 21 gènes, par exemple, d'un système NGS complète et ciblée. Le système intègre la quantification fonctionnelle de l'ADN et de la qualification, l'enrichissement par PCR multiplexée à tube unique, et la purification de la bibliothèque et de la normalisation en utilisant analytiquement-vérifiés, des réactifs de source unique avec une suite de bioinformatique autonomes.En conséquence, la variante précise des appels de faible qualité et à faible quantité fixés au formol, enrobés de paraffine (FFPE) et l'aiguille fine (FNA) biopsies tumorales peuvent être atteints. Le procédé peut évaluer systématiquement les variantes associées au cancer provenant d'une entrée de 400 copies d'ADN amplifiables, et il est conçu de façon modulaire pour accueillir un nouveau contenu génétique. Deux types de contrôles analytiquement définis différentes fournissent l'assurance de la qualité et de l'aide sauvegarde la précision des appels avec des échantillons cliniquement pertinents. Une étape flexible "tag" de PCR intègre adaptateurs spécifiques à la plate-forme et les codes d'index pour permettre barcoding de l'échantillon et la compatibilité avec paillasse commun instruments NGS. Fait important, le protocole est simplifié et peut produire 24 bibliothèques de séquence prêt en une seule journée. Enfin, l'approche relie les processus de banc humide et sèche en incorporant les résultats de contrôle de la qualité de l'échantillon pré-analytique directement dans la variante d'appel des algorithmes pour améliorer la précision de la détection de mutations et de se différencier de faux négatifs et indetermappels onnées. Cette méthode NGS ciblée utilise les progrès dans les deux wetware et de logiciels pour atteindre haute profondeur, le séquençage et l'analyse multiplexée sensible des échantillons de cancer hétérogènes pour des applications de diagnostic.
la médecine de précision repose sur l'individualisation des options diagnostiques et thérapeutiques pour les patients. La promesse de traitements adaptés est une conséquence directe d'une meilleure compréhension des voies de maladies qui peuvent éclairer la liaison des diagnostics moléculaires et des thérapies ciblées. Par exemple, l'utilisation des thérapies moléculaires ciblées est passé de 11% à 46% entre 2003 et 2013 1, et les médicaments anti-cancer tels que le vemurafenib et crizotinib sont approuvés par la FDA avec des tests de diagnostic compagnon. Avec sa capacité à récupérer avec précision des cibles de séquence faible abondance dans les ensembles d'échantillons hautement multiplexées, séquençage de nouvelle génération (NGS) a émergé comme une méthode de choix pour évaluer les aberrations génétiques associées au cancer et à l'identification des cibles moléculaires pour la médecine de précision.
Les biopsies de tumeurs solides les plus courants pour les tests moléculaires comprennent fixés au formol, enrobés de paraffine (FFPE) et aspiration à l'aiguille fine (FNA) SPECIMens. Ces échantillons sont lourdes de faible quantité et / ou de faible qualité des acides nucléiques qui défient des évaluations précises NGS 2-5. NGS commerciales actuelles méthodes pour l'analyse de ces échantillons sont basés sur un patchwork de différents réactifs, protocoles et outils informatiques qui représentent des cibles mobiles d'améliorations continues. Par exemple, les changements de chimies et / ou logiciels essai ont eu lieu tous les 1-2 mois pour NGS kits les plus couramment utilisés ciblés 6. Cette instabilité reflète un manque de cohérence dans la construction et la vérification d'un système unifié pour NGS types d'échantillons difficiles, en particulier pour le dépistage du cancer, et met un fardeau indu aux laboratoires d'élaborer des protocoles cohérents qui sont optimisés à partir d'échantillons en résultats. En effet, un récent sondage auprès des utilisateurs NGS a mis en évidence les difficultés de ces technologies "évolution rapide", ainsi que les exigences pour établir, le contenu médical à une action, une expertise en bio-informatique ancrée, un Solidified et procédure intégrée qui peut être rapidement mis en œuvre, et la rationalisation des flux de travail et des protocoles simplifiés qui facilitent sur le tas 7. Dans cet article, un système complet de NGS ciblée est décrite qui aborde ces lacunes.
La méthodologie présentée intègre toutes les étapes de la procédure de pré-analytique post-analytique à la fois des bancs humides et sèches pour améliorer la précision, la sensibilité et la fiabilité de la quantification de la cible et la détection pour NGS de loci des gènes du cancer cliniquement pertinentes. Cette approche commence par la quantification de l' ADN "fonctionnel" 4 pour évaluer la qualité de l' ADN, guide d' entrée dans l'étape d'enrichissement PCR, et se prémunir contre les appels faux positifs qui peuvent découler de l'interrogatoire de très faibles copies de modèles. Un multiplex unique tube PCR enrichit ensuite pour les gènes du cancer 46 loci à 21 en utilisant seulement 400 copies d'ADN amplifiables, suivie par l'incorporation de séquences spécifiques à la plateforme pour NGS using bureau commun instruments de séquençage. Les bibliothèques sont purifiés en utilisant une procédure de bille magnétique simple et quantifiées avec un roman, essai qPCR sans calibrage. Une suite de bioinformatique autonomes, informés par l'ADN QC résultats de l'échantillon pour améliorer les performances d'appel, fournit une analyse de séquence suivante NGS. Nous présentons des données en utilisant cette approche systémique NGS ciblée pour révéler des mutations de base de substitution, insertion / délétions (indels), et le nombre de copies variantes (CNV) dans des biopsies de faible qualité et à faible quantité tumorales tels que FFPE et des échantillons de cytoponction, et courir contrôles.
Technologies NGS ont redéfini les attentes pour interroger les profils moléculaires de biopsies tumorales dans les milieux cliniques 9. Un certain nombre de panneaux NGS ciblés ont été mis au point des technologies de recherche, des tests de laboratoire mis au point, et des produits disponibles dans le commerce et des panneaux personnalisés pour évaluer plusieurs types d'échantillons cliniques 3,5,10-15. Les rapports de plusieurs études ont démontré la valeur de NGS comme outil clinique sensible et spécifique pour la détection des altérations génomiques 3,10-12,14. Pourtant , les études ont également démontré le risque d'artefacts qui peuvent causer des résultats faussement positifs provenant de biopsies de cancer difficiles telles que FFPE spécimens 2-5,12,14. En outre, des publications récentes ont mis en évidence des taux élevés d'échec pour NGS en utilisant l' oncologie spécimens 16 et de faux positifs appels avec des panneaux NGS commerciales ciblées qui sont aggravées par l'utilisation de l' ADN à faible entrée 12. Par conséquent, certains laboratories ont modifié ou ajouté des freins et contrepoids supplémentaires disponibles dans le commerce des technologies NGS ciblées pour améliorer les performances, souvent pour assurer l' exactitude ou de confirmer les résultats des analyses de la bioinformatique 5,10,11.
Le panneau 21-gène (figure 2) a été développé comme un contenu ciblé pour un système NGS global pour interroger, des mutations à une action sur la base des données probantes dans les types d'échantillons difficiles tels que FFPE et les biopsies tumorales cytoponction. Le flux de travail a un certain nombre d'avantages: 1) la cohérence en fournissant une couverture de amplicon uniforme (figures 3 et 4, tableau 3); 2) la facilité d'utilisation en fournissant des pré-formulé, des ensembles de réactifs optimisés, et de simplifier les exigences en matière de bio-informatique; 3) l'efficacité en rationalisant le flux de travail et en réduisant le nombre d'étapes de pipetage par rapport à d'autres méthodes de NGS commerciales; et 4) la précision en incorporant un test ADN QC pour évaluer l'amplifimesure le nombre de copies d'ADN pour assurer la diversité de modèles acceptables et éviter les fluctuations stochastiques dans la détection de la variante 4. L'intégration des données de QC pré-analytique avec l'analyse bioinformatique permet de faibles entrées de FFPE ADN. Ceci a été réalisé par la formation d'un algorithme d'arbre de décision en utilisant différentes copies fonctionnelles de l'entrée de l'ADN dans 400 échantillons FFPE avec des mesures indépendantes de la vérité, et en intégrant cet algorithme dans le logiciel bioinformatique. Par conséquent, l'entrée recommandée de 400 copies amplifiables, typiquement équivalente à ~ 5 à 20 ng d'ADN FFPE, se compare favorablement à d' autres méthodes, y compris l' enrichissement de 10-12 à base d' hybridation , où ~ 250 ng d'ADN FFPE est recommandé 17,18 . Bien que la technique est décrit pour une utilisation sur une plate-forme de MiSeq, il peut être modifié en utilisant des amorces de PCR Tag avec des adaptateurs spécifiques à l'instrument pour permettre une analyse de séquence sur d'autres plates-formes NGS.
Plusieurs étapes sont essentielles pour assurer le succèsde la procédure. CQ dosage pré-analytique détermine le nombre de copies de l'ADN et amplifiable rapports d'inhibition fonctionnelle. Cependant, si elle est inférieure à 400 copies d'ADN amplifiables sont utilisés dans l'étape d'enrichissement par PCR, il existe un risque accru d'un appel de faux négatifs à partir d' échantillons présentant des mutations de faible abondance (figure 6). En outre, il faut prendre soin lors de la purification bibliothèque pour éviter une sur-séchage des billes magnétiques pendant le lavage ou élution étapes. De plus, le succès de quantification de la bibliothèque est fortement dépendante de la dilution précise de la banque d'ADN. Pour le meilleur résultat, la différence de qPCR résultats pour la bibliothèque de l'échantillon (Cq FAM) par rapport à la LQ standard (Cq VIC) devrait être ≤3.3 Cq. Si la différence est supérieure à 3,3 Cq, re-dilution et le test de l'échantillon est recommandée. Bien qu'une excellente corrélation a été observée entre cette méthode concurrentielle qPCR et des kits commerciaux qui offrent une quantification absolue en utilisant une courbe standardUn décalage de l'entrée de bibliothèque dans l'étape d'amplification clonale par rapport à d'autres méthodes peuvent être nécessaires pour obtenir une densité d'ensemencement optimale.
Certains spécimens de cancer sont particulièrement difficiles à séquencer en raison des inhibiteurs qui persistent après l'isolement de l'ADN. Pour identifier ces échantillons avant la préparation bibliothèque, le test qPCR QC détecte également l'inhibition de l'amplification en incluant un modèle exogène qui sert à la fois un contrôle interne et une sentinelle pour l'inhibition fonctionnelle. Un exemple est présenté dans la figure 3 , dans lequel un échantillon d'ADN de mélanome n'a pas réussi à passer le QC inhibition métrique avant le séquençage et n'a pas réussi à générer une bibliothèque qui pourrait être séquencé. L'échec était probablement une conséquence de la contamination de la mélanine, un inhibiteur de PCR connu, reporté de l'étape d'isolement FFPE ADN. Les échantillons qui sont identifiés par le test QC pour être à risque d'échec de l'amplification peut être récupéré grâce à un supplément de nettoyage étape to éliminer les inhibiteurs potentiels.
Le panneau 21-gène ciblé se concentre sur les points chauds de gènes basés sur des données probantes et fournit un système complet avec des réactifs et des contrôles optimisés pour NGS et la bioinformatique logiciel qui est informé par pré-analytiques des résultats "fonctionnels" ADN quantification de l'ADN QC,. La méthode permet de détecter avec précision les mutations de base de substitution et indels à partir d'ADN faible apport d'intrants, et fournit un exemple d'un système NGS avec la possibilité d'élargir le contenu du panneau, pour détecter des variantes supplémentaires telles que CNV et être adapté pour le séquençage de l'ARN ciblé.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr Annette Schlageter pour examen du manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention CP120017 de la prévention du cancer et de l'Institut de recherche du Texas (PI: GJL).
2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
ROX | Asuragen | 145346 | |
Diluent | Asuragen | 145339 | |
DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
AIL001 – AIL048 (48) | |||
Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
AIL049 – AIL096(48) | |||
2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
Illumina MiSeq | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
Quantidex Reporter Software | Asuragen |