Summary

Эпикардиального вырост Культура Анализ и<em> Ex Vivo</em> Оценка эпикардиального производный миграции клеток

Published: March 18, 2016
doi:

Summary

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Abstract

Один слой эпикарда клеточных линий сердца, обеспечивая паракринной факторов, которые стимулируют пролиферацию кардиомиоцитов и непосредственно способствует сердечно-сосудистых клеток-предшественников во время развития и болезней. В то время как ряд факторов, которые были вовлечены в клетки (EPDC) мобилизации эпикарда происхождения, механизмы, регулирующие их последующую миграцию и дифференцировку плохо изучены. Здесь мы представляем в пробирке и стратегии бывших естественных условиях для изучения EPDC моторику и дифференциации. Во-первых, мы опишем метод получения первичных эпикардиальные клеток путем вырост культуры из эмбрионального сердца мыши. Введем также подробный протокол для оценки трехмерной миграции меченых EPDC в системе органной культуры. Мы предоставляем доказательства того, используя эти методы, что генетическое удаление myocardin связанных факторов транскрипции в эпикарда затухает миграции EPDC. Такой подход служит платформой для оценки кандидатов модификаторов EPDCбиологии и может быть использовано для разработки генетических или химических экранов для выявления новых регуляторов мобилизации EPDC, которые могут быть полезны для сердца ремонта.

Introduction

Эпикард представляет собой один слой мезотелиальной клеток, что линии сердца и последствия развития сердца, созревание и ремонт. Благодаря хорошо скоординированным обмена паракриновых сигналов, Интимной диалог между миокарда и эпикарда является необходимым условием для остановки роста и формирования не-миоцитов сердца родословных 1. Эпикардиального клетки , полученные из (EPDC) выходят из подмножества эпикарда клеток через эпителиальные-к-мезенхимальных перехода (EMT) 2, вторгнуться в субэпикардиального пространство и основной миокард и дифференцируются в основном в коронарных сосудов стенной клеток и сердечных фибробластов, а также к в меньшей степени, эндотелиальные клетки и кардиомиоциты 3-9.

Механизмы , регулирующие эпикардиального EMT и EPDC вторжения были отнесены к скоординированным действиям различных молекул , включая секретируемых лигандов 10-13 рецепторов клеточной поверхности и молекул адгезии 14,15, регулиляторов апикального-базальной полярности 16,17, малые GTPases 18,19 и факторов транскрипции 2,20,21. В то время как многие из молекулярных эффекторов миграции EPDC были определены, более глубокое понимание физиологических сигналов, которые стимулируют мобилизацию EPDC в зародыше может ускорить разработку стратегий для управления этим процессом в взрослых для улучшения ремонта сердца.

Исследования, направленные на выявление новых регуляторов мобилизации EPDC полагаются на очистку этой популяции клеток или проследить миграцию отдельных клеток эпикарда. Один или комбинации генов – маркеров, в том числе Wt1, Tcf21, Tbx18, и / или Aldh1a2, обычно используется для идентификации плода эпикарда 1. Тем не менее, использование этих маркеров для отслеживания миграции EPDC не является оптимальным, как экспрессия маркеров эпикарда убывание в течение развития сердца и часто теряется, когда эпикарда клетки подвергаются transdifференциации в мезенхимальных клетках.

Применение системы Cre / LoxP, в сочетании с LINEAGE-трассировку репортеров, было полезно в постоянно мечения эпикарда и его потомков в процессе развития сердца и после ишемического повреждения во взрослом 7,22,23. Несколько эпикардиальные с ограничением Cre линии были сформированы и широко используются для обозначения EPDC и условной делеции гена стратегий 1. Эти исследования привели к характеристике различных эпикардиальные линий, а также выявление критических медиаторов EPDC моторики и дифференциации. Тем не менее, накапливая данные также свидетельствуют о эпикард представляет собой гетерогенную популяцию клеток – предшественников 4,24,25. Таким образом, только часть эпикарда клеток будут направлены с использованием данного драйвера Cre.

Для того, чтобы маркировать всю эпикарда независимо от специфики Cre, ряд лабораторий использовали нарост CULTure системы или исключая виво методы органной культуры , чтобы точно изолировать или этикетку эпикардиальные клетки , не в зависимости от экспрессии генетической линии маркеров 26-28. Для исследований бывших естественных условиях миграции, эмбриональные сердца изолированы до эпикарда EMT и культивируют в среде , дополненной с зеленым флуоресцентным белком (GFP) -expressing аденовируса (Ad / GFP) 9,18. Такой подход позволяет эффективно маркировки всей эпикарда, а не подмножества клеток с помощью Cre-опосредованной рекомбинации. Сердце культуры впоследствии подвергается воздействию известных индукторов EMT , чтобы стимулировать мобилизацию EPDC 28,29. Ex естественных условиях и в естественных условиях анализов дополняются в пробирке эпикардиальные эксплантов культур, которые являются особенно полезным подходом для изучения детальных механизмов вождения миграции EPDC.

Здесь мы опишем методы выделения первичных эпикардиальные клеток для исследований в пробирке epicardiаль ЕМТ, а также система органной культуры для экс виво анализ EPDC моторики. Недавно мы продемонстрировали полезность и надежность этого метода с помощью методов генной модуляции myocardin связанных фактора транскрипции (MRTF) / коэффициент отклика сыворотки (ОСР) ось сигнализации для управления актина на основе миграции EPDC 9. В то время как наши данные подчеркивают один сигнальный путь, необходимый для регулирования миграции EPDC, эти методы пригодны для разгадке механизмов, которые в совокупности оркестрировать миграцию и дифференцировку EPDC. Кроме того, эксплантов и бывших естественных условиях системы культуры могут быть реализованы в функциональных экранов для идентификации новых регуляторов мобилизации EPDC для терапевтических применений в регенерации сердца.

Protocol

Примечание: Все эксперименты с мышами были одобрены Университетской комитета по изучению ресурсов животного мира при Университете Рочестера с. 1. эпикардиального вырост Культура Анализ (Рисунок 1А) Препараты Подготовка 5 мл среды А для первичной изоляции эпикарда клеток…

Representative Results

Эпикард может быть эффективно изолированы с использованием анализа культуры нарост, воспользовавшись его внешней расположения и эксплуатации пластичностью развития и предлагает внутреннюю миграционную поведение EPDC. Мышиные эмбриональные сердца изолированы на E11.5…

Discussion

Здесь мы приводим подробные методы , чтобы изолировать первичную эпикардиального клетку путем разрастания и отслеживать миграцию EPDC в бывших естественных культурах сердца. Для нарост культур, подходящее время для удаления эпикарда обедненного сердце изменяется незначительно м?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

EMS была поддержана грантами от Национальных Институтов Здоровья (NIH) [номер гранта R01HL120919]; Американской ассоциации сердца [номер гранта 10SDG4350046]; Университет Рочестера CTSA награду от NIH [номер гранта UL1 TR000042]; и запуска средства из Aab CVRI. MAT была частично поддержана грантом в Университете Рочестера школы медицины и стоматологии от Med INTO-Град Инициатива Медицинского института Говарда Хьюза; и Национальной премии Сервис Исследования Institutional Ruth L. Kirschstein из NIH [номер гранта GM068411].

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone  SH3002201 DMEM
Hanks' Balanced Salt Solution Hyclone SH3003102 HBSS
Medium 199 Hyclone SH3025301 M199
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline  Hyclone SH3002802 DPBS
Fetal Bovine Serum  Gemini  100-106 FBS
Penicillin/Streptomycin Solution Hyclone SV30010
Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides Corning 354557
Multiwell 24-well plates Falcon 08-772-1
Dissecting microscope Leica M50 Equipped with Leica KL300 LED might source
Confocal miscroscope Olympus 1X81 Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp
Bioruptor Diagenode  UCD-200
Transforming growth factor beta 1 R&D Systems 100-B-001 TGF-β1
Platelet-derived growth factor BB R&D Systems 220-BB-010 PDGF-BB
Trizol Reagent Applied Biosystems 15596-026 Caution, hazardous material
TURBO DNA-free Kit Life Technologies AM1907 DNaseI
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 1708891
UltraPure Glycogen Life Technologies 10814-010
SYBR Green BioRad 170-8880
Protease inhibtor cocktail tablets Roche 11836170001
Alexa Goat-anti-rabbit 488 Life Technologies A11008 Secondary antibody
Alexa Goat anti-rabbit 594 Life Technologies A-11012 Secondary antibody
Alexa Goat anti-mouse 594 Life Technologies A-11005 Secondary antibody
Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated  Sigma-Aldrich C6198 monoclonal antibody, clone 1A4
Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) Life Technologies MA1-46028 monoclonal antibody, clone 6F-H2
Rabbit anti-ZO1 Life Technologies 40-2200 polyclonal antibody
Rabbit anti-Collagen Type 4 Millipore AB756P polyclonal antibody
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride  Life Technologies D1306 DAPI
Fluorescent mounting medium  DAKO S3023
16% Paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15710 PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue Freezing Medium Triangle Biomedical Sciences TFM-B
Pap pen DAKO S2002
Disposable mictrotome blades  Sakura Finetek 4689
Microscope slides Globe Scientific 1358W positively charged, 25 x 75 x 1mm
Cryostat  Leica CM1950
Forceps Fine Science Tools 11295-00
Surgical Scissors Fine Science Tools 91460-11
Disposable base molds Fisher Scientific 22-363-553
Ketamine Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine Akorn NADA 139-236

Referências

  1. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  2. Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
  3. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
  4. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
  5. Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
  6. Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
  7. Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
  8. Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
  9. Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
  10. Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
  11. von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
  12. Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
  13. Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
  14. Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
  15. Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
  16. Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
  17. Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
  18. Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
  19. Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
  20. Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
  21. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
  22. Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
  23. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
  24. Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
  25. Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
  26. Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
  27. Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
  28. Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
  29. Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
  30. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
  31. Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
  32. Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
  33. Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
  34. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
  35. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
  36. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  37. Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
  38. Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
  39. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
  40. Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
  41. Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
  42. Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
  43. Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
  44. Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
  45. Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
  46. Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).

Play Video

Citar este artigo
Trembley, M. A., Velasquez, L. S., Small, E. M. Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration. J. Vis. Exp. (109), e53750, doi:10.3791/53750 (2016).

View Video