El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Los gliomas son una clase de cánceres de cerebro neuroepiteliales derivadas de la glía transformado dentro del sistema nervioso central (SNC). De todos los gliomas, Organización Mundial de la Salud (OMS) glioma de grado IV, o glioblastoma (GBM), es el más común y letal ^1. GBM es altamente refractaria a la atención estándar de corriente que consta de la resección del tumor a la medida de lo posible seguida de radiación y quimioterapia concomitante y adyuvante con temozolomida ^2. Estos cánceres mortales tienen un pronóstico sombrío de sólo 15 a 18 meses de supervivencia desde el momento del diagnóstico inicial con sólo el 5% de los pacientes que sobreviven la enfermedad después de ⁵ años 3.

La presencia de la barrera hematoencefálica (BBB), la falta de células presentadoras de antígenos profesionales (APC), y la existencia previamente no identificado de estructuras linfáticas de buena fe dentro del cerebro ⁴ han dado lugar a la noción de GBM como inmune privilegiados. Sin embargo, numerosos estudios ahora show que estos cánceres de cerebro de hecho generan el reclutamiento de células inmunes periféricos que son predominantemente de origen mieloide, que incluyen monocitos, macrófagos y células supresoras mieloides derivadas de MDSCs ^(5). GBM también influye en la actividad de la microglia del cerebro residente para convertirse en pro-tumorigénico ^6,7. Las células linfoides tales como células T CD8 ^{+ 8 y} CD56 células ⁺ asesinas naturales ⁹ también están presentes en el microambiente del tumor, pero en mucho menor número, un hecho piensa que es debido a la función inmunosupresora instigado por factores de glioma derivado de macrófagos asociados al tumor ( TAM) ^10. Las células T CD4 ⁺ también están presentes en GBM, pero gran parte de esta población también expresa CD25 y FoxP3, los responsables de inmunosupresora T reguladoras _(Treg) células ^11. El estado inmunosupresor general de GBM culmina en la promoción de evasión inmunológica y la progresión tumoral ^12.

<p class= "jove_content"> Una mejor comprensión de los mecanismos de GBM inmunosupresión es fundamental para el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas eficaces para estimular el sistema inmune contra el tumor. En los últimos 15 años, nuestro laboratorio ha trabajado para superar los mecanismos de immunosuppresson tumor cerebral con el fin de desarrollar eficaces nuevas inmunoterapias anti-MBG ^13-19. La culminación de este trabajo ha dado lugar a un ensayo clínico diseñado para evaluar un citotóxico combinado y terapéutico inmune-estimulantes para los pacientes con diagnóstico reciente (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT01811992) GBM.

Nuestro trabajo más reciente muestra que GL26 de ratón y de rata CNS-1 células GBM bloquean antitumoral de las células NK vigilancia inmunológica mediante la producción de grandes cantidades de la lectina de unión a β-galactosidasa-galectina-1 (Gal-1) ^20. Esto se demostró mediante la supresión de la expresión de gal-1 en células de glioma usando mediada por shRNA desmontables gen. In vitro experiments mostraron que las células de glioma-gal 1-deficiente proliferaron normalmente en cultivo, sin embargo, fueron sometidos a rechazo rápido pronto después del injerto singénico intracraneal en ratones C57BL / 6J o RAG1 ^{– / – ratones,} estableciendo así la independencia de T o células B en esta forma de el rechazo del tumor. Immunodepletion células NK con anti-asialo GM ₁ anti-suero o anticuerpos monoclonales NK1.1 llevó a la restauración completa de glioma intracraneal crecimiento gal-1-deficientes, se crea la función de las células NK en gal-1-deficiente rechazo glioma. Ahora demuestran que immunodepletion de las células mieloides GR-1 ⁺ / CD11b ⁺ es suficiente para prevenir el rechazo de glioma gal-1-deficiente a pesar de la presencia de células NK, revelando así un papel auxiliar indispensable para las células mieloides en la ayuda a la gal mediada por NK lisis tumoral -1-deficiente (datos no publicados). Este resultado inesperado nos ha llevado a desarrollar un protocolo integral para el aislamiento y el análisis de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) queinfiltrarse en el microambiente del tumor cerebral poco después el injerto intracraneal para que podamos caracterizar mejor los eventos de infiltración inmunes que predican el rechazo glioma gal-1-deficientes.

El método se demuestra aquí utilizando células de glioma GL26 de ratón que la proteína fluorescente mCitrine expresan constitutivamente, llamado GL26-Cit, que permite la visualización directa de las células tumorales mediante microscopía de fluorescencia ^21. Estas células se estereotácticamente injertaron en el cerebro de singénicos ratones C57BL / 6J y se dejaron crecer durante 24, 48, o 72 hr antes de la eutanasia del ratón. PBMCs glioma infiltrantes son entonces aislados y immunolabeled utilizando anti -CD45, -GR-1, -CD11b y -NK1.1 anticuerpos de la superficie celular, junto con immunolabeling intracelular de granzima B (GzmB). Esta combinación específica de anticuerpos permite la identificación de Gr-1 ^{+ / +} células CD11b infiltrantes de tumores mieloides y NK1.1 ^+, células NK, los tipos de células que tenemos been implicado en el rechazo del tumor gal-1-deficientes. El perfil inmunológico de la infiltración gal-1-deficiente GL26-Cit glioma, se hace referencia aquí como GL26-Cit-gal1i, se compara entonces con la de gliomas que expresan niveles normales de gal-1 llamado GL26-Cit-NT que contienen un no- focalización de control shRNA horquilla. El protocolo comienza con una descripción de cómo la cultura células GL26-Cit glioma in vitro, que es seguido por una explicación sobre cómo injertar ortotópicamente estas células en el cuerpo estriado de singeneicos C57BL / 6J. A continuación, procede a enumerar los pasos implicados en el aislamiento y la inmunomarcación de PBMCs de glioma infiltrantes para el análisis de citometría de flujo. El protocolo concluye con una explicación de análisis de datos estándar y representación gráfica.

La manifestación revela que tanto Gr-1 ⁺ / CD11b ^{+ células} mieloides y células NK1.1 ⁺ NK preferentemente acumularse dentro del microambiente del tumor cerebral gal-1-deficientes dentro de 48h de la implantación del tumor, un resultado que ayuda a explicar por qué estos tumores se someten rápidamente lisis tumoral completa aproximadamente 1 semana injerto post-tumoral ^20. El método es fácilmente adaptable a una serie de diferentes diseños experimentales in vivo en el que se requieren los datos temporales sobre la infiltración inmune en el cerebro. Un único experimentador puede realizar el protocolo de recolección cerebro para análisis citométrico de flujo de PBMCs de glioma infiltrantes en aproximadamente 4-6 horas, dependiendo del número de muestras a analizar. El método también se puede combinar con experimentos destinados para caracterizar el perfil de la circulación de PBMCs en ratones portadores de tumor para la comparación con los que se infiltran en el cerebro para identificar fenotipos de inmunosupresión específicamente inducidos por el microambiente tumoral. La aplicación de este y otros métodos debería facilitar una mejor comprensión de los factores que intervienen en el tráfico de células inmunes periféricas en el microambiente del tumor cerebral.