L'isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

Les gliomes sont une classe de cancers du cerveau résultant de la glie neuro-épithéliales transformées dans le système nerveux central (SNC). De tous les gliomes, Organisation mondiale de la Santé (OMS) de grade IV gliome, ou le glioblastome (GBM), est la plus fréquente et mortelle ^1. GBM est hautement réfractaire au traitement standard-de-courant qui se compose de résection de la tumeur dans la mesure du possible, plus suivie d'une radiothérapie chimiothérapie concomitante et adjuvante avec ² témozolomide. Ces cancers mortels portent un pronostic sombre de seulement 15-18 mois de survie à partir du moment du diagnostic initial avec seulement 5% des patients survivent à la maladie après 5 ^ans 3.

La présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE), le manque de cellules présentatrices d'antigène professionnelles (APC), et l'existence non identifiés auparavant des structures lymphatiques de bonne foi dans le cerveau ⁴ ont conduit à la notion de GBM comme immunitaire privilégié. Cependant, de nombreuses études sho maintenantw que ces cancers du cerveau engendrent en effet le recrutement de cellules immunitaires périphériques qui sont principalement à l'origine myéloïde incluant les monocytes, les macrophages et les cellules myéloïdes suppressives (MDSC dérivés ^5). GBM influe également sur ​​l'activité de cerveau-résident microglie à devenir pro-tumorigènes ^6,7. Les cellules lymphoïdes telles que les cellules ^T CD8 + ^{8 et} cellules CD56 ⁺ tueuses naturelles ⁹ sont également présents dans le microenvironnement de la tumeur, mais en beaucoup moins grand nombre, un fait semble être due à la fonction immunosuppressive incité par des facteurs de gliome dérivés sur les macrophages associés aux tumeurs ( TAM) ^{10. Lymphocytes} T CD4 + sont également présents dans GBM, mais une grande partie de cette population exprime également CD25 et FoxP3, les responsables de immunosuppresseur T régulatrices (T _reg) ^cellules 11. L'état immunosuppresseur globale de GBM culmine dans la promotion de l'évasion immunologique et la progression de la tumeur ^12.

<p class= "jove_content"> Une meilleure compréhension des mécanismes de la GBM immunosuppression est essentielle à l'élaboration de stratégies immunothérapeutiques efficaces conçus pour stimuler le système immunitaire contre la tumeur. Au cours des 15 dernières années, notre laboratoire a travaillé à surmonter les mécanismes de immunosuppresson de tumeur au cerveau afin de développer de nouveaux produits immunothérapeutiques efficaces anti-GBM ^13-19. Le point culminant de ce travail a conduit à un essai clinique visant à évaluer un cytotoxique combinée et thérapeutique immuno-stimulation pour les patients nouvellement diagnostiqués (identificateur ClinicalTrials.gov: NCT01811992) GBM.

Notre travail le plus récent montre que GL26 de la souris et de rat SNC-1 des cellules de glioblastome bloquent anti-tumorale des cellules NK surveillance immunitaire en produisant de grandes quantités de la β-galactoside lectine liant la galectine-1 (gal-1) ^20. Cela a été démontré par la suppression de l'expression de gal-1 dans les cellules de gliome utilisant knockdown de gènes shRNA médiation. In vitro expérits ont montré que les cellules de gliome Gal-1 déficient prolifèrent normalement dans la culture, mais ont subi un rejet rapide, peu après la prise de greffe intracrânienne dans des souris C57BL / 6J ou RAG1 ^{souris – / -,} établissant ainsi l'indépendance de T ou cellules B sur cette forme de rejet de la tumeur. NK immunodéplétion de la cellule avec un anticorps anti-asialo _GM1 anti-sérum ou des anticorps NK1.1 monoclonaux dirigés à la restauration complète de l'évolution de gliome gal-1-deficient intracrânienne, en établissant le rôle des cellules NK en gal-1-deficient rejet de gliome. Nous montrons maintenant que immunodéplétion des cellules myéloïdes Gr-1 ⁺ / CD11b ⁺ est suffisante pour prévenir le rejet d'un gliome gal-1 déficiente en dépit de la présence de cellules NK, révélant ainsi un rôle d'auxiliaire indispensable pour les cellules myéloïdes dans l'aide apportée à l'gal NK médiée lyse tumorale -1 déficiente (données non publiées). Ce résultat inattendu nous a conduit à développer un protocole détaillé pour l'isolement et l'analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) quiinfiltrer le microenvironnement d'une tumeur cérébrale, peu après la prise de greffe intracrânienne afin que nous puissions mieux caractériser les événements d'infiltration immunitaires qui prédicat rejet de gliome gal-1 déficient.

La méthode est démontré ici en utilisant des cellules de gliome de GL26 de souris qui expriment constitutivement mCitrine protéine fluorescente, appelée GL26-Cit, qui autorisent la visualisation de la cellule tumorale directe par microscopie à fluorescence ^21. Ces cellules sont greffées stéréotactique dans le cerveau de souris C57BL / 6J et syngéniques sont laissées se développer pendant 24, 48 ou 72 heures avant l'euthanasie des souris. PBMC de gliome infiltrant sont ensuite isolés et immunomarquées utilisant des anticorps anti -CD45, -GR-1, et -CD11b -NK1.1 anticorps de surface cellulaire conjointement avec immunomarquage intracellulaire de granzyme B (GZMB). Cette combinaison permet d'anticorps spécifique pour l'identification des Gr-1 ^{+ / +} CD11b cellules myéloïdes infiltrant les tumeurs et NK1.1 ^+, les cellules NK, les types de cellules, nous avons been impliqué dans le rejet de la tumeur gal-1 déficient. Le profil d'infiltration immunitaire de Gal-1-deficient GL26-Cit gliome, appelé ici GL26-Cit-gal1i, est ensuite comparée à celle des gliomes exprimant des taux normaux de Gal-1 appelé GL26-Cit-NT qui contiennent une non- ciblant le contrôle shRNA épingle à cheveux. Le protocole commence par une description sur la façon de la culture des cellules GL26-Cit gliome in vitro, qui est suivie d'une explication sur la façon de greffer orthotopiquement ces cellules dans le striatum de souris C57BL / 6J syngéniques. Il procède ensuite à énumérer les étapes impliquées dans l'isolement et l'immunomarquage des PBMC de gliome infiltrant pour l'analyse par cytométrie en flux. Le protocole se termine par une explication de l'analyse de données standard et de représentation graphique.

La démonstration révèle que les deux Gr-1 ⁺ / ⁺ CD11b cellules myéloïdes et les cellules NK NK1.1 ⁺ accumuler de préférence dans le microenvironnement tumeur cérébrale gal-1 déficient dans les 48h d'implantation de la tumeur, un résultat qui contribue à expliquer pourquoi ces tumeurs subissent rapidement lyse tumorale complète d'environ 1 semaine de prise de greffe tumorale ^post-20. Le procédé est facilement adaptable à un certain nombre de différents modèles expérimentaux in vivo dans lequel des données temporelles sur infiltration immunitaire dans le cerveau est nécessaire. Un seul expérimentateur peut effectuer le protocole de récolte cerveau analyse cytométrique de flux de PBMC de gliome infiltrant en environ 4-6 heures en fonction du nombre d'échantillons à analyser. Le procédé peut également être combiné avec des expériences visant à caractériser le profil de circulation des PBMC chez les souris porteuses de tumeur pour la comparaison avec ceux qui infiltrent le cerveau afin d'identifier les phénotypes d'immunosuppression spécifiquement induites par le micro-environnement de la tumeur. Application de la présente et des méthodes similaires devrait faciliter une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans le trafic de cellules immunitaires périphériques dans le microenvironnement de la tumeur du cerveau.