מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.
המעבדה שלנו הוכיחה לאחרונה כי רוצח טבעי (NK) תאים מסוגלים לחסל GL26 עכבר מושתל orthotopically ועכברוש CNS-1 גליומות הממארת מייד לאחר קליטתם תוך גולגולתי אם תאי הסרטן ניתנים לקויים בביטוים של הקטינים galectin β-galactoside מחייב -1 (גל-1). עוד העבודה האחרונה החברה מראה כי אוכלוסייה של תאי מיאלואידית + / CD11b + Gr-1 היא קריטית להשפעה זו. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים שבאמצעותם תאי NK ומיאלואידית לשתף פעולה כדי להעניק דחיית גידול גל-1-חסר פיתחנו פרוטוקול מקיף לבידוד והניתוח של תאים שחדרו-גליומה ההיקפיים mononuclear הדם (PBMC). השיטה הוכיחה כאן על ידי השוואת חדירת PBMC למייקרו-הסביבה של הגידול של גל-1-להביע GL26 גליומות עם אלה שניתנו גל-1-לקוי באמצעות מציאה shRNA. הפרוטוקול מתחיל בתיאור של איך תרבות ולהכין לסה"נ GL26LLS לחיסון לתוך מוח עכבר C57BL / 6J syngeneic. לאחר מכן הוא מסביר את השלבים כרוכים בניתוח cytometric בידוד וזרימה של PBMCs הסתננות-גליומה ממייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם. השיטה ניתנת להתאמה למספר in vivo עיצובים הניסיוניים שבו נתונים זמניים על חדירת חיסון לתוך המוח נדרש. השיטה היא רגישה מאוד לשחזור, כפי שניתן לבודד מגידולים תוך-גולגולתי PBMCs הסתננות-גליומה בהקדם engraftment הודעה גידולי 24 שעות עם ספירת תאים דומה נצפתה מגידולי נקודת זמן המתאים בכל ניסויים בלתי תלויים. בניסויים בודדים יכולים לבצע את השיטה מקצירת המוח לזרום ניתוח cytometric של PBMCs הסתננות-גליומה בכ 4-6 שעות, תלוי במספר דגימות להיות מנותח. גם דגמי גליומה אלטרנטיביים ו / או נוגדני זיהוי תא ספציפי ניתן להשתמש בשיקול דעתם של experimentalists להעריך את החדירה של כמה immun האחרסוגי תאי דואר של עניין ללא צורך בשינויים בהליך הכולל.
גליומות היא מחלקה של סרטן מוח neuroepithelial הנובע מגליה הפכה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS). של כל גליומות, ארגון בריאות עולמי (WHO) גליומה IV כיתה, או גליובלסטומה (GBM), הוא נפוצה וקטלני ביותר 1. GBM הוא עקשן מאוד לטיפול הסטנדרטי של שוטף הכולל כריתת גידול ולאחריו קרינה בתוספת כימותרפיה במקביל ואדג'ובנט בטקסול 2 במידה האפשר. סוגי הסרטן קטלניים אלה נושאים פרוגנוזה עגומה של רק 15-18 חודשים של הישרדות מרגע אבחון ראשוני עם רק 5% מהחולים ששרדו את המחלה לאחר 5 שנים 3.
נוכחותו של מחסום דם המוח (BBB), חוסר בתא הצגת אנטיגן המקצועי (נגמ"שים), וקיום בלתי מזוהה בעבר מבני הלימפה בתום לב בתוך המוח 4 הובילו לרעיון של GBM חיסוני כחסוי. עם זאת, מחקרים רבים עכשיו sho w שסרטן המוח אלה אכן לעורר הגיוס של תאים חיסוניים היקפיים שהם בעיקר מיאלואידית במקור הכוללים מונוציטים, מקרופאגים, ותאי שמקורם מיאלואידית המדכאים (MDSCs) 5. GBM גם משפיע על הפעילות של מיקרוגליה מוח-התושב להפוך פרו-סרטני 6,7. תאי הלימפה כגון תאי CD8 + T 8 ותאים + רוצח טבעי CD56 9 נמצאים גם בתוך מייקרו-הסביבה של הגידול, אבל בהרבה פחות מספרים, למעשה חשבו להיות בשל תפקוד לדיכוי מערכת החיסון ביוזמת גורמים שמקורם בגליומה במקרופאגים גידול קשור ( שירות רפואי לנוער) 10. תאי CD4 + T נמצאים גם בGBM, אבל הרבה של אוכלוסייה זו מבטא גם CD25 וFoxP3, מקבלי של דיכוי המערכת החיסונית (T reg) רגולציה תאים T 11. המדינה מדכאות את מערכת החיסון הכוללת של GBM מגיע לשיאו בקידום בריחה החיסונית והתקדמות גידול 12.
<p class= "Jove_content"> הבנה טובה יותר של המנגנונים של דיכוי חיסוני GBM היא קריטית לפיתוח אסטרטגיות טיפול חיסוניים יעילות שנועדו לעורר את המערכת החיסונית נגד הגידול. במהלך 15 השנים האחרונות במעבדה שלנו עבדה כדי להתגבר על המנגנונים של immunosuppresson גידול במוח על מנת לפתח immunotherapeutics אנטי GBM החדש היעיל 13-19. שיאו של עבודה זו הובילה כעת לניסוי קליני שנועד להעריך ציטוטוקסיות בשילוב וטיפולי חיסוני גירוי בחולים עם (מזהה ClinicalTrials.gov: NCT01811992) שאובחן לאחרונה GBM.העבודה האחרונה שלנו מראה כי מערכת העצבים המרכזית-1 תאי GBM GL26 העכבר והחולדה לחסום מעקב חיסוני תא NK אנטי-סרטני על ידי ייצור כמויות גדולות של קטיני β-מחייב galactoside galectin-1 (גל-1) 20. זה הודגם על ידי דיכוי הביטוי של גל-1 בתאי גליומה באמצעות מציאה גן בתיווך shRNA. במבחנה experimenTS הראה כי תאי גליומה גל-1-חסר התרבו בדרך כלל בתרבות, עדיין עבר דחייה מהירה מייד לאחר קליטתם תוך גולגולת לתוך C57BL / 6J או RAG1 syngeneic – / – עכברים, וכך לבסס את עצמאותה של טי או B- תאים בצורה זו של דחיית גידול. immunodepletion תא NK עם אנטי-asialo GM 1 אנטי-סרום או נוגדנים חד שבטיים NK1.1 הובילו לשיקום צמיחת גליומה גל-1-לקויה תוך גולגולת השלם, הקמת התפקיד של תאי NK בגל-1-לקוי דחיית גליומה. אנו מציגים כעת immunodepletion שתאי מיאלואידית Gr-1 + / CD11b + מספיק כדי למנוע דחיית גליומה גל-1-לקוי למרות נוכחותם של תאי NK, ובכך חושף את תפקיד עזר הכרחי לתאי מיאלואידית שבמסייעת לגל של תיווך NK תמוגה -1 הלקויה גידול (נתונים שלא פורסמו). תוצאה בלתי צפויה זה הובילה אותנו לפתח פרוטוקול מקיף לבידוד והניתוח של תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) שלחדור מייקרו-סביבת גידול במוח מייד לאחר קליטתם תוך גולגולתי, כך שנוכל לאפיין טוב יותר את אירועי חדירה חיסוניים שלבסס דחיית גליומה גל-1-חסר.
השיטה הוכיחה כאן על ידי שימוש בתאי גליומה GL26 עכבר שחלבון mCitrine constitutively המפורש ניאון, נקרא GL26-Cit, המאפשרים הדמיה תאים סרטניים ישירה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 21. תאים אלה engrafted stereotactically לתוך המוח של עכברי C57BL / 6J syngeneic ומותרים לגדול במשך 24, 48, או 72 שעות לפני המתת חסד עכבר. אז PBMCs הסתננות-גליומה מבודדים וimmunolabeled באמצעות -CD45 אנטי, -Gr-1, -CD11b ו-NK1.1 נוגדנים פני תא יחד עם immunolabeling תאיים לgranzyme B (GzmB). השילוב הספציפי הזה של נוגדנים מאפשר זיהוי של Gr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית חדירת גידול וNK1.1 +, תאי NK, סוגי תאים יש לנו בeen מעורב בדחיית גידול גל-1-חסר. פרופיל החדירה החיסונית של גליומה GL26-Cit גל-1-חסר, המכונה כאן GL26-Cit-gal1i, לעומת אז לזה של גליומות להביע רמות נורמליות של בשם GL26-Cit-NT גל-1 המכילות אי מיקוד סיכת ראש shRNA שליטה. הפרוטוקול מתחיל בתיאור על איך תרבות תאי גליומה GL26-Cit במבחנה, ואחריו הסבר על איך נקלט orthotopically תאים אלה לסטריאטום של C57BL / 6J syngeneic. לאחר מכן הוא ממשיך למנות את השלבים כרוכים בבידוד וimmunolabeling של PBMCs הסתננות-גליומה לניתוח התזרים cytometric. הפרוטוקול מסתיים בהסבר של ניתוח נתונים סטנדרטי וייצוג גרפי.
ההפגנה מגלה כי שני Gr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית ותאי NK NK1.1 + מעדיפים לצבור בתוך מייקרו-סביבת גידול במוח גל-1-לקוי בתוך 48שעות של השתלת גידול, תוצאה אשר מסייעת להסביר מדוע גידולים אלה במהירות לעבור תמוגה גידול המלאה engraftment הודעה גידול-כ 1 שבוע 20. השיטה היא להתאמה בקלות למספר עיצובים ניסיוניים שונים בvivo שבו נתונים זמניים על חדירת חיסון לתוך המוח נדרש. בניסויים בודדים יכולים לבצע את הפרוטוקול מקצירת המוח לזרום ניתוח cytometric של PBMCs הסתננות-גליומה בכ 4-6 שעות, תלוי במספר דגימות להיות מנותח. השיטה גם עשויה להיות משולבת עם ניסויים שמטרה לאפיין את הפרופיל של מחזורי PBMCs בעכברי נושאי גידול להשוואה עם אלה שלחדור למוח כל כך לזהות פנוטיפים דיכוי חיסוני הנגרמים במיוחד על ידי מייקרו-הסביבה של הגידול. יישום של שיטות וזה דומה צריך להקל הבנה טובה יותר של הגורמים מעורבים בסחר בתאים חיסוניים ההיקפיים למייקרו-סביבת גידול במוח.
פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה ושחזור לניתוח הבידוד ותזרים cytometric של PBMCs שהסתנן למייקרו-סביבת גידול במוח העכבר המוקדם. השעיות תא גליומה נוצרות בריכוז שצוין על ידי בניסויים שengrafted stereotactically לסטריאטום של מוח העכבר. עכברים מורדמים אז בנקודות זמן קבועות מראש שצוינו על ידי עיצ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות / המכון לאומי להפרעות ושבץ (NIH / NINDS) מעניק R01-NS074387, R01-NS057711 וR21-NS091555 לMGC נוירולוגיות; NIH / NINDS מעניק R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 וR21-NS084275 לPRL; מענקים מהלבבות השמחים של לאה, אוניברסיטת מרכז הסרטן המקיף מישיגן זכה לMGC וPRL; המחלקה לנוירוכירורגיה, אוניברסיטת מישיגן בית הספר לרפואה; מכון מישיגן לקליני ומחקר בריאות, נתמך על ידי מענק NIH 2UL1-TR000433; גרנט הדרכת ביולוגיה של אוניברסיטת מישיגן הסרטן נתמך על ידי NIH / T32-CA009676 המענק NCI (המכון הלאומי לסרטן); אוניברסיטת מישיגן ההדרכה במדעי המוח קליני והבסיסיים הנתמכות על ידי NIH / NINDS להעניק T32-NS007222; ואוניברסיטת מישיגן רפואית מדען תכנית אימונים נתמכה על ידי NIH / NIGMS (המכון הלאומי למדעי רפואה כלליים) להעניק T32-GM007863. המחבריםמחדש אסיר תודה על המנהיגות האקדמית ותמיכה שקיבלה מד"ר קארין Muraszko והמחלקה לנוירוכירורגיה; למ 'Dahlgren, ד Tomford, וס Napolitan לתמיכה ניהולית מעולה; למ 'Dzaman לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל; ופיל פ ג'נקינס לתמיכה נדיבה כלפי רכישת Zeiss 3D מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. אנחנו גם מכירים המעבדה Kuchroo בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד שממנו הגרסה שונה של האסטרטגיה בתיווך תקשורת צנטריפוגה הצפיפות לבידוד של תאי mononuclear מוח נמשכת.
Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000U/ml Penicillin; 10,000μg/ml Streptomycin |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200mM |
G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1mm deep |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10ml vials |
0.6ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5mg/ml solution |
Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100mg/ml solution |
Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5mg/ml solution |
Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100mg/ml solution |
Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50mg/ml solution |
Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3mg/ml ampuls |
1ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
26G x ½ (0.45mm x 13mm) syringe needles | BD | 305111 | |
Surgical clippers | 3M | 9661 | |
Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
1.7ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter® Syringes 700 series; 5μl volume |
Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9mm diameter x 50mm length (5/16" diameter x 2" length) |
1L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000U/ml solution |
Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
20G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9mm x 38.1mm |
Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume |
Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
Hemostat | FST | 13014-14 | |
Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
7ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
10 mL serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
70μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
15ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
50ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |