בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

גליומות היא מחלקה של סרטן מוח neuroepithelial הנובע מגליה הפכה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS). של כל גליומות, ארגון בריאות עולמי (WHO) גליומה IV כיתה, או גליובלסטומה (GBM), הוא נפוצה וקטלני ביותר ^1. GBM הוא עקשן מאוד לטיפול הסטנדרטי של שוטף הכולל כריתת גידול ולאחריו קרינה בתוספת כימותרפיה במקביל ואדג'ובנט בטקסול ² במידה האפשר. סוגי הסרטן קטלניים אלה נושאים פרוגנוזה עגומה של רק 15-18 חודשים של הישרדות מרגע אבחון ראשוני עם רק 5% מהחולים ששרדו את המחלה לאחר 5 שנים ^3.

נוכחותו של מחסום דם המוח (BBB), חוסר בתא הצגת אנטיגן המקצועי (נגמ"שים), וקיום בלתי מזוהה בעבר מבני הלימפה בתום לב בתוך המוח ⁴ הובילו לרעיון של GBM חיסוני כחסוי. עם זאת, מחקרים רבים עכשיו sho w שסרטן המוח אלה אכן לעורר הגיוס של תאים חיסוניים היקפיים שהם בעיקר מיאלואידית במקור הכוללים מונוציטים, מקרופאגים, ותאי שמקורם מיאלואידית המדכאים (MDSCs) ^5. GBM גם משפיע על הפעילות של מיקרוגליה מוח-התושב להפוך פרו-סרטני ^6,7. תאי הלימפה כגון תאי CD8 ⁺ T ⁸ ותאים ⁺ רוצח טבעי CD56 ⁹ נמצאים גם בתוך מייקרו-הסביבה של הגידול, אבל בהרבה פחות מספרים, למעשה חשבו להיות בשל תפקוד לדיכוי מערכת החיסון ביוזמת גורמים שמקורם בגליומה במקרופאגים גידול קשור ( שירות רפואי לנוער) ^10. תאי CD4 ⁺ T נמצאים גם בGBM, אבל הרבה של אוכלוסייה זו מבטא גם CD25 וFoxP3, מקבלי של דיכוי המערכת החיסונית (T _reg) רגולציה תאים T ^11. המדינה מדכאות את מערכת החיסון הכוללת של GBM מגיע לשיאו בקידום בריחה החיסונית והתקדמות גידול ^12.

<p class= "Jove_content"> הבנה טובה יותר של המנגנונים של דיכוי חיסוני GBM היא קריטית לפיתוח אסטרטגיות טיפול חיסוניים יעילות שנועדו לעורר את המערכת החיסונית נגד הגידול. במהלך 15 השנים האחרונות במעבדה שלנו עבדה כדי להתגבר על המנגנונים של immunosuppresson גידול במוח על מנת לפתח immunotherapeutics אנטי GBM החדש היעיל ^13-19. שיאו של עבודה זו הובילה כעת לניסוי קליני שנועד להעריך ציטוטוקסיות בשילוב וטיפולי חיסוני גירוי בחולים עם (מזהה ClinicalTrials.gov: NCT01811992) שאובחן לאחרונה GBM.

העבודה האחרונה שלנו מראה כי מערכת העצבים המרכזית-1 תאי GBM GL26 העכבר והחולדה לחסום מעקב חיסוני תא NK אנטי-סרטני על ידי ייצור כמויות גדולות של קטיני β-מחייב galactoside galectin-1 (גל-1) ^20. זה הודגם על ידי דיכוי הביטוי של גל-1 בתאי גליומה באמצעות מציאה גן בתיווך shRNA. במבחנה experimenTS הראה כי תאי גליומה גל-1-חסר התרבו בדרך כלל בתרבות, עדיין עבר דחייה מהירה מייד לאחר קליטתם תוך גולגולת לתוך C57BL / 6J או RAG1 syngeneic ^{– / –} עכברים, וכך לבסס את עצמאותה של טי או B- תאים בצורה זו של דחיית גידול. immunodepletion תא NK עם אנטי-asialo GM ₁ אנטי-סרום או נוגדנים חד שבטיים NK1.1 הובילו לשיקום צמיחת גליומה גל-1-לקויה תוך גולגולת השלם, הקמת התפקיד של תאי NK בגל-1-לקוי דחיית גליומה. אנו מציגים כעת immunodepletion שתאי מיאלואידית Gr-1 ⁺ / CD11b ⁺ מספיק כדי למנוע דחיית גליומה גל-1-לקוי למרות נוכחותם של תאי NK, ובכך חושף את תפקיד עזר הכרחי לתאי מיאלואידית שבמסייעת לגל של תיווך NK תמוגה -1 הלקויה גידול (נתונים שלא פורסמו). תוצאה בלתי צפויה זה הובילה אותנו לפתח פרוטוקול מקיף לבידוד והניתוח של תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) שלחדור מייקרו-סביבת גידול במוח מייד לאחר קליטתם תוך גולגולתי, כך שנוכל לאפיין טוב יותר את אירועי חדירה חיסוניים שלבסס דחיית גליומה גל-1-חסר.

השיטה הוכיחה כאן על ידי שימוש בתאי גליומה GL26 עכבר שחלבון mCitrine constitutively המפורש ניאון, נקרא GL26-Cit, המאפשרים הדמיה תאים סרטניים ישירה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ^21. תאים אלה engrafted stereotactically לתוך המוח של עכברי C57BL / 6J syngeneic ומותרים לגדול במשך 24, 48, או 72 שעות לפני המתת חסד עכבר. אז PBMCs הסתננות-גליומה מבודדים וimmunolabeled באמצעות -CD45 אנטי, -Gr-1, -CD11b ו-NK1.1 נוגדנים פני תא יחד עם immunolabeling תאיים לgranzyme B (GzmB). השילוב הספציפי הזה של נוגדנים מאפשר זיהוי של Gr-1 ⁺ / CD11b ⁺ תאי מיאלואידית חדירת גידול וNK1.1 ^+, תאי NK, סוגי תאים יש לנו בeen מעורב בדחיית גידול גל-1-חסר. פרופיל החדירה החיסונית של גליומה GL26-Cit גל-1-חסר, המכונה כאן GL26-Cit-gal1i, לעומת אז לזה של גליומות להביע רמות נורמליות של בשם GL26-Cit-NT גל-1 המכילות אי מיקוד סיכת ראש shRNA שליטה. הפרוטוקול מתחיל בתיאור על איך תרבות תאי גליומה GL26-Cit במבחנה, ואחריו הסבר על איך נקלט orthotopically תאים אלה לסטריאטום של C57BL / 6J syngeneic. לאחר מכן הוא ממשיך למנות את השלבים כרוכים בבידוד וimmunolabeling של PBMCs הסתננות-גליומה לניתוח התזרים cytometric. הפרוטוקול מסתיים בהסבר של ניתוח נתונים סטנדרטי וייצוג גרפי.

ההפגנה מגלה כי שני Gr-1 ⁺ / CD11b ⁺ תאי מיאלואידית ותאי NK NK1.1 ⁺ מעדיפים לצבור בתוך מייקרו-סביבת גידול במוח גל-1-לקוי בתוך 48שעות של השתלת גידול, תוצאה אשר מסייעת להסביר מדוע גידולים אלה במהירות לעבור תמוגה גידול המלאה engraftment הודעה גידול-כ 1 שבוע ^20. השיטה היא להתאמה בקלות למספר עיצובים ניסיוניים שונים בvivo שבו נתונים זמניים על חדירת חיסון לתוך המוח נדרש. בניסויים בודדים יכולים לבצע את הפרוטוקול מקצירת המוח לזרום ניתוח cytometric של PBMCs הסתננות-גליומה בכ 4-6 שעות, תלוי במספר דגימות להיות מנותח. השיטה גם עשויה להיות משולבת עם ניסויים שמטרה לאפיין את הפרופיל של מחזורי PBMCs בעכברי נושאי גידול להשוואה עם אלה שלחדור למוח כל כך לזהות פנוטיפים דיכוי חיסוני הנגרמים במיוחד על ידי מייקרו-הסביבה של הגידול. יישום של שיטות וזה דומה צריך להקל הבנה טובה יותר של הגורמים מעורבים בסחר בתאים חיסוניים ההיקפיים למייקרו-סביבת גידול במוח.