Выделение и проточной цитометрии анализ глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови

Глиомы представляют собой класс нейроэпителиальных рака головного мозга, вытекающих из трансформированной глии в центральной нервной системе (ЦНС). Из всех глиом, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) класса IV глиомы, глиобластомы или (GBM), является наиболее распространенным и смертельный ^1. GBM является весьма резистентны к текущей стандарт оказания медицинской помощи, которая состоит из удаления опухоли в максимально возможной степени с последующим излучением плюс сопутствующей и адъювантной химиотерапии темозоломидом ^2. Эти смертоносные раки нести мрачный прогноз только 15-18 месяцев выживания с момента установления диагноза с только 5% больных, перенесших заболевание после 5 лет ^3.

Наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), отсутствие профессиональных антиген-представляющих клеток (БТР), и ранее неизвестный наличие добросовестных лимфатических структур в мозге ⁴ привели к понятию GBM, как иммунной привилегированных. Тем не менее, многочисленные исследования в настоящее время шож, что эти рака мозга действительно порождают набор периферийных иммунных клеток, которые преимущественно миелоидной происхождения, которые включают моноциты, макрофаги, и миелоидных полученных клеток-супрессоров (MDSCs) ^5. GBM также влияет на деятельность головного мозга резидентом микроглии стать про-онкогенные ^6,7. Лимфоидных клеток, такие как ^CD8 + Т-клеток ^{8 и} CD56 ⁺ натуральных киллеров ⁹ также присутствуют в опухоли микроокружения, но в гораздо меньшем количестве, факт считается, в связи с иммуносупрессивной функции спровоцированного глиомы, полученных факторов на ассоциированных с опухолью макрофаги ( ТАМ) ^{10. CD4} + T-клетки также присутствуют в GBM, но многое из этого населения также выражает CD25 и FoxP3, производители иммуносупрессивной T нормативной (T) клеток _обл ^11. Общая иммуносупрессивной состояние GBM завершается в продвижении иммунологической побега и опухолевой прогрессии ^12.

<p class= "jove_content"> Более глубокое понимание механизмов иммуносупрессии GBM имеет решающее значение для разработки эффективных иммунотерапевтических стратегий, направленных на стимулирование иммунной системы против опухоли. За последние 15 лет наша лаборатория работала, чтобы преодолеть механизмы мозга опухоли immunosuppresson в целях развития эффективных новых анти-GBM Immunotherapeutics ^13-19. Кульминацией этой работы в настоящее время привело к клиническому испытанию, предназначенный для оценки комбинированного цитотоксические и иммунной стимулирующее терапевтическое для пациентов с впервые выявленным GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).

Наша последняя работа показывает, что GL26 мыши и крысы ЦНС 1 GBM клетки блокируют противоопухолевую НК клеток иммунного надзора по производству больших количеств β-галактозид лектина галектин-1 (Gal-1) ^20. Это было продемонстрировано путем подавления экспрессии Gal-1 в клетках глиомы, используя shRNA-опосредованной генной нокдаун. В пробирке экспериментальTS показали, что Гал-1-дефицитных клеток глиомы распространение как правило, в культуре, но подверглись быстрому отказ вскоре после внутричерепного приживления сингенным C57BL / 6J или RAG1 ^{– / –} мышей, таким образом, установление независимости Т- или В- клеток на этом виде отказ опухоли. НК клеток immunodepletion с анти-асиало GM ₁ анти-сыворотки или моноклональных антител NK1.1 привели к полному восстановлению внутричерепного Гал-1-дефицитных роста глиомы, устанавливающих роль NK-клеток в Гал-1-дефицитных отказа глиомы. Покажем теперь, что immunodepletion ГР-1 ⁺ / CD11b ⁺ миелоидной клетки достаточно, чтобы предотвратить гал-1-дефицитных отказ глиомы, несмотря на наличие NK клеток, таким образом, открывая незаменимым вспомогательную роль для миелоидных клеток в пособничестве в НК-опосредованной гал -1-дефицитных лизиса опухоли (неопубликованные данные). Этот неожиданный результат привел нас к разработке комплексной протокол для выделения и анализа мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК), чтопроникнуть в микросреду опухоли мозга вскоре после внутричерепного приживления, чтобы мы могли лучше характеризуют иммунную инфильтрации события, которые предикатов гал-1-дефицитных отказ глиомы.

Метод демонстрируется здесь с помощью мыши GL26 глиомы клетки, которые конструктивно экспресс mCitrine флуоресцентный белок, называемый GL26-CIT, которые позволяют прямой визуализации опухолевых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии ^21. Эти клетки стереотаксически привиты в мозг сингенных C57BL / 6J и давали расти в течение 24, 48 или 72 ч до мыши эвтаназии. Глиомы инфильтрирующие РВМС затем выделяют и immunolabeled с использованием анти -CD45, -GR-1, -CD11b и -NK1.1 клеточной поверхности антитела вместе с внутриклеточной иммунноокрашивания для гранзима (GzmB). Это специфическое сочетание антител позволяет идентифицировать опухолевых инфильтрующих GR-1 ^{+ / CD11b-миелоидных} клеток и NK1.1 ^+, NK клеток, клеточных типов имеем Вееп вовлечен в гал-1-дефицитных отторжение опухоли. Иммунная профиль инфильтрация гал-1-дефицитных GL26-чит глиомы, называемый здесь GL26-чит-gal1i, затем по сравнению с глиом, выражающих нормальные уровни Гал-1 под названием GL26-чит-НТ, которые содержат не- ориентации управления shRNA шпильку. Протокол начинается с описания о том, как культура GL26-Соч клеток глиомы в пробирке, которая сопровождается объяснением о том, как привить ортотопически эти клетки в стриатуме сингенным C57BL / 6J. Затем переходит перечислить этапы выделения и иммунноокрашивания глиомы инфильтрирующие МНПК для анализа потока цитометрии. Протокол заключает с объяснением стандартного анализа и графического представления.

Демонстрация показывает, что оба Гр-1 ⁺ / CD11b ⁺ миелоидных клеток и NK NK1.1 ⁺ клетки преимущественно накапливаются в гал-1-дефицитных опухолей головного мозга микросреды в 48ч имплантации опухоли, в результате которых помогает объяснить, почему эти опухоли быстро пройти полный лизис опухоли примерно 1 неделю после приживления опухоли ^20. Способ может быть легко адаптирован к ряду различных естественных экспериментальных в конструкции, в которых требуется временные данные по иммунной инфильтрации в головном мозге. Один экспериментатор может выполнить протокол от уборки мозга течь цитометрический анализ глиомы инфильтрирующие МНПК примерно 4-6 часа в зависимости от количества анализируемых образцов. Способ также может быть объединена с экспериментов, направленных охарактеризовать профиль циркулирующего РВМС в мышей, несущих опухоли для сравнения с тем, что проникают в головной мозг, так, чтобы идентифицировать иммуносупрессии фенотипы частности, вызванные опухоли микроокружения. Применение этой и подобных методов должно способствовать лучшему пониманию факторов, участвующих в торговле периферийных иммунных клеток в опухоли микроокружения головного мозга.