Vi beskriver en teknikk for å merke nevroner og deres prosesser via anterograd eller retrograd tracer injeksjoner i hjernekjerner benytter pt de vitro forberedelse. Vi endret en eksisterende metode for jeg n vitro tracer elektroporering ved å utnytte fluorescensmerket mus mutanter og grunnleggende optisk utstyr for å øke merking nøyaktighet.
Vi presenterer en teknikk som kombinerer en in vitro tracer injeksjon protokollen, som bruker en rekke elektriske og trykkpulsene å øke fargestoff opptak gjennom elektroporering i hjernen eksplantater med målrettede laser belysning og matchende filterbriller under inngrepet. Den beskrevne teknikk for in vitro electroporation av seg selv gir relativt god visuell kontroll for målretting av visse områder av hjernen. Ved å kombinere det med laser eksitasjon av fluorescerende genetiske markører og deres lese ut gjennom bånd passerer filterbriller, som kan plukke opp utslippene av de genetisk merkede celler / kjerner og fluorescerende sporing fargestoff, kan en forsker øke nøyaktigheten av injeksjoner ved å finne området av interesse og kontrollerende for dye-spredning / opptak i injeksjon området mye mer effektivt. I tillegg gjør laserbelysning teknikk for å undersøke funksjonaliteten til en gitt neurocircuit av providing informasjon om typen av nerveceller som rager til et bestemt område i de tilfeller hvor GFP uttrykk er knyttet til sendertype uttrykt ved en subpopulasjon av neuroner.
For å definere en viss neuronal (mikro) krets, må man begynne med å finne de forskjellige deltagerne i nevnte krets, og deres forbindelse mønster. Helt siden Waller publikasjon om neurofiber sporing gjennom lesioning pt et stort utvalg av nevroanatomi følgeteknikk er etablert. Noen av disse teknikkene kan anvendes i fast vev post mortem 2-4, andre er avhengige av den aktive transport av fargestoffet i levende neuroner, som ble oppdaget i 1971 5-6. Det sistnevnte kan videre deles i to grupper diskriminere mellom fremgangsmåter som benytter seg av aktiv retrograd (fra det injiserte område til kilden for et gitt fremspring, dvs. Den somata av nevroner som projiserer til nevnte område) og aktiv antero (fra det injiserte område til målet på en gitt projeksjon, altså. de aksonale projeksjoner og aksonale terminalene på merket nevroner) transport. Også, i noen tilfeller tracer materiale injiseres i levende dyr som deretter overlever injeksjonen av flere dager eller uker (in vivo spor injeksjoner), mens i andre tilfeller eksplanterte hjerner er injisert, og inkuberes i flere timer etter injeksjonen i kunstig cerebrospinalvæske (in vitro tracer injeksjoner) .
I denne protokollen endret vi en eksisterende in vitro electroporation teknikken 7-8 å merke nevronale somata og prosesser i anterograd og retrograd Tracing eksperimenter med choleratoxin subenhet-b og tetramethylrhodamine dekstran som tracing stoffer. Det overordnede målet med denne protokollen er å gi nevrologer med et effektivt verktøy for å spore nevronale tilkoblingsmønsteret mellom ulike hjernekjerner, og samtidig utnytte tilgjengelige transgene mus linjer og grunnleggende optisk utstyr for å øke målretting nøyaktighet under tracer injeksjoner. Selv om metoden for antero og retrograd sporing ved hjelpcholeratoxin og dekstran amin og deres respektive fluorescerende merkede konjugater er ikke ny 9-13 (som er den metode for elektroporering, f.eks. Haas et al. 14), kombinasjonen av tracer injeksjoner med elektroporering i en in vitro-preparatet omfatter blokker av hjernevev er en nyere utvikling 7. Dens viktigste fordel i forhold til neuronal følgeteknikk ved bruk av samme type tracer fargestoffer i levende dyr er den økte merking intensitet, på grunn av den høyere effektivitet med hvilken elektroporert fargestoffet blir tatt opp av nerveceller. En ytterligere fordel er den forkortede inkubasjonsperioden (nødvendig for fargestoffet transport) og dens target øket nøyaktighet i løpet av sporstoffinjeksjons, fordi experimenter har visuell kontroll over målområdet av injeksjonen. Det sistnevnte betyr også at ingen dyre stereoutstyr er nødvendig for å finne kjernen eller hjerneområde av interesse.
Til Addinalt øke målretting nøyaktighet, vi tok fordel av en transgen mus linje, som uttrykker GFP i sin glycinergic undergruppe av nevroner 15 og grunnleggende optisk utstyr som består av en håndholdt laserpeker over 405 nm bølgelengde og matchende band-pass filtrering briller (450 – 700 nm). Således oppnådde vi en betydelig ytterligere økning av målretting nøyaktighet ved å identifisere injeksjonsstedet gjennom sin fluorescerende signal, og ved å tilveiebringe en bedre måte å kontrollere for fargestoffet spredning innenfor injeksjonsstedet gjennom observasjon av interaksjonen mellom egne GFP signalet og tracer fluorescens. Vår teknikk gjør det også mulig å avdekke funksjonaliteten til en krets sammen med sin tilkobling ved å identifisere GFP-positive hemmende nerveceller (eller eksitatoriske i andre mus linjer) som ble fylt med tracer.
I sammendraget, vi ytterligere forsterket et kraftig nevrovitenskapelig verktøy for å studere connectome av virveldyr hjernen og vurdere tHan ulike nevroanatomi funksjoner i en gitt neurocircuit. Ved å bruke transgene mus sammen med billig og allment tilgjengelig optisk utstyr var vi i stand til å betydelig øke målretting nøyaktigheten av våre injeksjoner. Videre transgene mus tillatt oss å identifisere hvilken type de spores tilkoblinger, som bidro til å avdekke funksjonaliteten til en hemmende mikrokrets i den auditive hjernestammen.
En generell styrken in vitro tracer electroporation, i motsetning til in vivo-studier tracing, er at det gir forskere bedre adgang til hjernen område av interesse og derfor ikke innebærer dyrt stereotaktisk (og ofte elektro) utstyr. I tillegg overlevelsesperioden som er nødvendig for hjerne eksplantater spenner over bare noen få timer (1 – 4) i stedet for dager eller uker i tilfelle av in vivo tracer injeksjoner (en detaljert redegjørelse for anvendelse av dekstran aminer og andre sporsto…
The authors have nothing to disclose.
Støttet av NIH / NIDCD R01 DC 011582. Imaging eksperimenter ble utført ved universitetet i Colorado Anschutz medisinske høyskole Avansert lysmikroskopi Kjerne støttes delvis av NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Antall UL1 RR025780 og Rocky Mountain Neurlogical Disorders Kjernesenter Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac fra Salk Institute gitt oss de GlyT2-GFP mus.
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
Potassium chloride | P9333 | ||
Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
Magnesium chloride | M2670 | ||
Calcium chloride | C5080 | ||
Glucose | G7528 | ||
Sodium bicarbonate | S6297 | ||
Ascorbic acid | A4544 | ||
Myo-inositol | I5125 | ||
Sodium pyruvate | P2256 | ||
Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
Agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
Perfusion setup | Custom-made | ||
Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |