Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

Um eine bestimmte neuronale (Mikro-) Schaltung zu definieren, muß man durch Auffinden der verschiedenen Teilnehmer der Schaltung und ihre Verbindungsstruktur zu beginnen. Seit Wallers Publikation über neurofiber Verfolgung durch Läsion ¹ eine Vielzahl von neuroanatomischen Tracing-Techniken hergestellt wurde. Einige dieser Techniken können in festen Gewebe post mortem ^2-4 angewendet werden, andere stützen sich auf den aktiven Transport des Farbstoffes in lebenden Neuronen, wie 1971 ^5-6 entdeckt. Letztere kann weiter in zwei Gruppen Unterscheiden zwischen Methoden unter Ausnutzung der aktiven retrograden unterteilt werden (von der Injektionsstelle zu der Quelle eines gegebenen Vorsprungs, dh. Die Zellkörper von Neuronen, die vorstehen, sind an der Fläche) und aktive anterograde (von der eingespritzten Bereich in den Ziel einer gegebenen Projektion, d. axonalen Vorsprüngen und den axonalen Anschlüssen des markierten Neuronen) transport. Auch in einigen Fällen tracer Material in lebende Tiere, die dann überleben die Injektion von mehreren Tagen oder Wochen (in vivo Tracer Injektionen), während in anderen Fällen explantierten Gehirn injiziert werden und Inkubation für mehrere Stunden nach der Injektion in der künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit injiziert (in vitro Tracer Injektionen) .

In diesem Protokoll modifizierten wir ein in vitro Elektroporationstechnik ^7-8 bestehende neuronale Zellkörper und Prozesse in anterograden und retrograden Verfolgungsexperimente mit Choleratoxin-Untereinheit B und Tetramethylrhodamin Dextran als Verfolgungssubstanzen zu markieren. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Neurowissenschaftler mit einem effizienten Werkzeug, um neuronale Konnektivität Muster zwischen verschiedenen Hirnkerne verfolgen zu schaffen, und gleichzeitig die Vorteile der verfügbaren transgenen Mauslinien und Grund optische Geräte, um die Zielgenauigkeit beim Tracer Injektionen erhöhen. Obwohl das Verfahren der anterograden und retrograden Verfolgung mitCholeratoxin und Dextran Amin und ihre jeweiligen fluoreszenzmarkierten Konjugaten ist nicht neu ^9-13 (ebenso wie die Methode der Elektroporation, z. Haas et al. ^14), die Kombination von Tracer-Injektionen mit Elektroporation in einem in vitro-Präparat mit Blöcken von Hirngewebe ist eine neuere Entwicklung ^7. Sein Hauptvorteil, neuronale Verfolgungstechniken unter Verwendung der gleichen Art von Tracer Farbstoffe in lebenden Tieren ist die erhöhte Markierungsintensität, wegen der höheren Effizienz, mit der das elektroporierte Farbstoff wird durch Neuronen entnommen. Ein zusätzlicher Vorteil ist die verkürzte Inkubationszeit (für die Farbstofftransport erforderlich) und seine erhöhte Zielgenauigkeit während der Tracerinjektion, weil der Experimentator visuelle Kontrolle über den Zielbereich der Injektion. Letzteres bedeutet, dass auch keine teuren stereo Ausrüstung erforderlich, um den Kern oder Gehirnbereich von Interesse zu finden.

Um additional erhöht Zielgenauigkeit, nutzten wir eine transgene Mauslinie, die GFP in seiner glycinergen Subpopulation von Neuronen ^{15 und} optischen Grundausrüstung, bestehend aus einem Hand-Laser-Pointer von 405 nm Wellenlänge und passenden Bandpassfilterung Brille (450 drückt – 700 nm). Somit eine erhebliche weitere Steigerung erzielten wir die Zielgenauigkeit durch die Identifizierung der Injektionsbereich durch seine Fluoreszenzsignals und durch Vorsehen einer feineren Weg für den Farbstoff Streuung in der Injektionsbereich durch Beobachtung der Wechselwirkung zwischen der indigenen GFP-Signals und der Kopierregel Fluoreszenz. Unser Verfahren ermöglicht es auch, die Funktion eines Schaltkreises zusammen mit der Konnektivität durch Identifizieren GFP-positive inhibitorische Neuronen (oder in anderen exzitatorischen Mauslinien), die mit dem Tracer gefüllt waren aufzudecken.

Zusammenfassend haben wir weiter verbessert ein leistungsfähiges Werkzeug, um die neuro Connectome des Wirbeltiergehirns zu studieren und zu beurteilen ter verschiedene neuroanatomische Merkmale eines gegebenen neurocircuit. Durch Verwendung von transgenen Mäusen zusammen mit preiswerten und überall erhältlich optische Geräte konnten wir die Zielgenauigkeit der Injektionen deutlich erhöhen. Darüber hinaus konnten wir die transgenen Mäuse, die Art der zurück Verbindungen, die Aufdeckung der Funktionalität einer inhibitorischen Mikroschaltung im auditorischen Hirnstamm geholfen zu identifizieren.