Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

Om een ​​bepaalde neuronale (micro) circuit definiëren, moet men beginnen door het vinden van de verschillende deelnemers van de schakeling, en de verbinding patroon. Sinds de publicatie Waller over neurofiber traceren door middel van laesie ¹ een grote verscheidenheid van neuroanatomische tracing technieken is vastgesteld. Sommige van deze technieken kunnen in vaste weefsel post mortem ^2-4 worden toegepast, andere vertrouwen op het actieve transport van de kleurstof in levende neuronen, zoals ontdekt in 1971 ^6/5. De laatste kunnen worden onderverdeeld in twee groepen discrimineren tussen verschillende maken van actieve retrograde (van het geïnjecteerde gebied om de bron van een bepaalde projectie, dwz. De somata van neuronen die uitsteken aan genoemde gebied) en actieve anterograde (van de geïnjecteerde gebied om de doelstelling van een bepaalde projectie, dwz. de axonale projecties en de axonale terminals van de gelabelde neuronen) vervoer. Ook in sommige gevallen tracer materiaal wordt geïnjecteerd in levende dieren die vervolgens overleven de injectie van verscheidene dagen of weken (in vivo tracer injecties), terwijl in andere gevallen geëxplanteerde hersenen geïnjecteerd en incubeer gedurende enkele uren na de injectie in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (in vitro tracer injecties) .

In dit protocol gewijzigde we een bestaand in vitro elektroporatie techniek ^7-8 neuronale somata en processen labelen in anterograde en retrograde tracing experimenten met choleratoxin subunit-b en tetramethylrhodamine dextran als tracing stoffen. De algemene doelstelling van dit protocol is te neurowetenschappers te voorzien van een efficiënt hulpmiddel om neuronale connectiviteit patronen tussen verschillende hersenkernen traceren, terwijl gebruik te maken van beschikbare transgene muis lijnen en eenvoudige optische apparatuur om targeting nauwkeurigheid tijdens tracer injecties te verhogen. Hoewel de werkwijze anterograde en retrograde traceren met behulpcholeratoxin en dextran amine en hun fluorescent gemerkte conjugaten niet nieuw ^9-13 (volgens de methode van elektroporatie, bijv. Haas et al. ^14), de combinatie van tracer injecties met elektroporatie de een in vitro bereiding met blokken van hersenweefsel is een meer recente ontwikkeling ^7. Zijn belangrijkste voordeel ten opzichte neuronale tracing technieken met dezelfde soort tracer kleurstoffen in levende dieren is de toegenomen labeling intensiteit, vanwege de hogere efficiëntie waarmee de geëlektroporeerde kleurstof wordt opgenomen door neuronen. Een bijkomend voordeel is de verkorte incubatietijd (vereist voor de kleurstof transport) en de grotere nauwkeurigheid doel tijdens de tracer injectie, omdat de experimentator visuele controle over het doelgebied van de injectie. Dit laatste betekent tevens dat geen dure stereotactische apparatuur nodig om de kern of hersengebied interessegebied.

Om addinaal verhogen targeting nauwkeurigheid, we hebben gebruik gemaakt van een transgene muis lijn, die GFP uitdrukt in zijn glycinergic subpopulatie van neuronen ^{15 en} eenvoudige optische apparatuur, bestaande uit een hand-held laser pointer van 405 nm golflengte en bijpassende banddoorlaatfiltering goggles (450 – 700 nm). Zo behaalden we een aanzienlijke verdere stijging van de doelgerichtheid nauwkeurigheid door de injectieplaats te identificeren door middel van haar fluorescerend signaal en door een fijnere manier om te controleren voor de kleurstof verspreiding in de injectie gebied door middel van de waarneming van de interactie tussen de inheemse GFP-signaal en de tracer fluorescentie. De techniek maakt het ook mogelijk om de functionaliteit van een circuit ontdekken met de connectiviteit door het identificeren van GFP-positieve remmende neuronen (of prikkelende andere muizenlijnen) die waren gevuld met de tracer.

Kortom, we verder versterkt een krachtig instrument om de neurowetenschappelijk connectoom van de gewervelde hersenen te bestuderen en te beoordelen thij verschillende neuroanatomische kenmerken van een bepaalde neurocircuit. Met behulp van transgene muizen met goedkope en overal verkrijgbaar optische apparatuur konden we aanzienlijke verhoging van de targeting nauwkeurigheid van onze injecties. Bovendien is de transgene muizen lieten het type getraceerd verbindingen, die hielp blootleggen van de functionaliteit van een remmende microcircuit in de auditieve hersenstam identificeren.