Vi beskriver en teknik til at mærke neuroner og deres processer via anterograd eller retrograd tracer injektioner i hjernekerner anvendelse af en in vitro præparat. Vi modificerede en eksisterende metode af i n vitro tracer elektroporering ved at udnytte fluorescensmærket mus mutanter og grundlæggende optisk udstyr med henblik på at øge nøjagtigheden mærkning.
Vi præsenterer en teknik, der kombinerer pt in vitro-sporstof injektion-protokollen, som bruger en række elektriske og tryk impulser til at øge farvestof optagelse gennem elektroporation i hjernen eksplantater med målrettet laser belysning og matchende filter beskyttelsesbriller under proceduren. Den beskrevne teknik in vitro elektroporering af sig selv giver forholdsvis god visuel kontrol for målretning visse områder af hjernen. Ved at kombinere det med laser excitation af fluorescerende genetiske markører og deres udlæsning via band-passerer filter beskyttelsesbriller, som kan hente udledningen af de genetisk mærkede celler / kerner og det fluorescerende opsporing farvestof, kan en forsker øge nøjagtigheden af injektioner ved at finde det område af interesse og styring for farvestoffet-spredning / optagelse i injektionen området langt mere effektivt. Hertil kommer, at laser illumination teknik gør det muligt at undersøge funktionaliteten af en given neurocircuit ved providing oplysninger om den type af neuroner rager til et bestemt område i tilfælde, hvor GFP-ekspression er forbundet med den type transmitter udtrykkes af en subpopulation af neuroner.
For at fastlægge en vis neuronal (mikro) kredsløb, må man starte med at finde de forskellige deltagere af nævnte kredsløb, og deres forbindelse mønster. Lige siden er blevet etableret Waller publikation om neurofiber opsporing gennem læsionsdannelsen 1 et stort udvalg af neuroanatomiske tracing teknikker. Nogle af disse teknikker kan anvendes i fikseret væv post mortem 2-4, andre er afhængige af den aktive transport af farvestoffet i levende neuroner, som opdagede i 1971 5-6. Sidstnævnte kan yderligere opdeles i to grupper, diskriminerer mellem metoder udnytter aktiv retrograd (fra det injicerede område til kilden til en given projektion, dvs.. Den somata af neuroner, der rager til nævnte område) og aktiv anterograd (fra den injicerede område til målet om en given projektion, dvs.. de axonale fremskrivninger og axonale terminaler mærkede neuroner) transport. Også i nogle tilfælde tracer materiale indsprøjtes i levende dyr, som derefter overlever injektionen af flere dage eller uger (in vivo tracer injektioner), mens der i andre tilfælde eksplanterede hjerner injiceres og inkuberes i flere timer efter injektionen i kunstig cerebrospinalvæske (in vitro tracer injektioner) .
I denne protokol ændrede vi en eksisterende in vitro elektroporation teknik 7-8 til at mærke neuronal somata og processer i anterograd og retrograd tracing forsøg med choleratoxin subunit-b og tetramethylrhodamin dextran som sporing stoffer. Det overordnede mål med denne protokol er at give neuroforskere med et effektivt redskab til at spore neuronale tilslutningsmuligheder mønstre mellem forskellige hjerneområder kerner, samtidig udnytte tilgængelige transgene mus linjer og grundlæggende optisk udstyr for at øge målretning nøjagtighed under tracer injektioner. Selvom metoden til anterograd og retrograd sporing hjælpcholeratoxin og dextran amin og deres respektive fluorescensmærkede konjugater er ikke ny 9-13 (som er metoden til elektroporering, f.eks. Haas et al. 14), kombinationen af tracer injektioner med elektroporering i et in vitro præparat involverer blokke af hjernevæv er en nyere udvikling 7. Dens vigtigste fordel i forhold til neuronale tracing teknikker under anvendelse af den samme type tracer farvestoffer i levende dyr er den øgede mærkning intensitet, på grund af den højere effektivitet, hvormed den elektroporerede farvestoffet bliver taget op af neuroner. En yderligere fordel er den forkortede inkubationstid (kræves til farvestoffet transport) og dets øgede ønskede nøjagtighed i tracer injektion, fordi forsøgslederen har visuel kontrol over målområdet injektionsstedet. Sidstnævnte betyder også, at ingen dyre stereotaktisk udstyr er påkrævet for at finde kernen eller hjerne område af interesse.
Til suppletionelt øge målretning nøjagtighed, vi drog fordel af en transgen mus linje, som udtrykker GFP i sin glycinergic underpopulation af neuroner 15 og grundlæggende optisk udstyr, der består af en håndholdt laser pointer på 405 nm bølgelængde og matchende band-pass filtrering beskyttelsesbriller (450 – 700 nm). Således opnåede vi en betydelig yderligere stigning i målretning nøjagtighed ved at identificere injektion området gennem sin fluorescerende signal og ved at give en finere måde at kontrollere for farvestoffet spredning inden injektionen område gennem observation af samspillet mellem den indfødte GFP signal og sporstoffet fluorescens. Vores teknik gør det også muligt at afdække funktionaliteten af et kredsløb sammen med sin tilslutning ved at identificere GFP-positive hæmmende neuroner (eller stimulerende i andre mus linjer), der var fyldt med sporstof.
Sammenfattende vi yderligere forstærket et kraftfuldt værktøj neurovidenskabelig at studere connectome af hvirveldyr hjernen og vurdere than forskellige neuroanatomiske funktioner i en given neurocircuit. Ved at anvende transgene mus sammen med billig og bredt tilgængelige optisk udstyr var vi i stand til at øge den målsøgende nøjagtigheden af vores injektioner. Desuden de transgene mus tilladt os at identificere typen af røbestof forbindelser, som hjalp afdække funktionaliteten af en hæmmende mikrokredsløb i den auditive hjernestammen.
En generel styrke in vitro sporstof elektroporering, i modsætning til in vivo tracing undersøgelser, er, at det giver forskere bedre adgang til hjernen område af interesse og dermed ikke indebærer dyre stereotaktisk (og ofte elektrofysiologisk) udstyr. Desuden overlevelse periode, der kræves for hjernen eksplantater spænder kun et par timer (1 – 4) i stedet for dage eller endda uger i tilfælde af in vivo tracer injektioner (se en detaljeret gennemgang om anvendelse af dextran aminer og …
The authors have nothing to disclose.
Støttet af NIH / NIDCD R01 DC 011582. Imaging blev udført på University of Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Core delvist understøttet af NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Antal UL1 RR025780 og Rocky Mountain Neurlogical Disorders Core center Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac fra Salk Institute forsynet os med de GLYT2-GFP mus.
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
Potassium chloride | P9333 | ||
Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
Magnesium chloride | M2670 | ||
Calcium chloride | C5080 | ||
Glucose | G7528 | ||
Sodium bicarbonate | S6297 | ||
Ascorbic acid | A4544 | ||
Myo-inositol | I5125 | ||
Sodium pyruvate | P2256 | ||
Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
Agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
Perfusion setup | Custom-made | ||
Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |