وصفنا تقنية لتسمية الخلايا العصبية والعمليات الخاصة بها عن طريق تقدمي أو رجعي التتبع الحقن في نوى الدماغ باستخدام إعداد في المختبر. نحن تعديل طريقة القائمة ط ن معمليا التتبع Electroporation للمن خلال الاستفادة من fluorescently المسمى المسوخ الماوس وأجهزة بصرية الأساسية من أجل زيادة دقة وضع العلامات.
نقدم الأسلوب الذي يجمع في المختبر التتبع بروتوكول الحقن، والذي يستخدم سلسلة من النبضات الكهربائية والضغط لزيادة امتصاص الصبغة من خلال Electroporation للفي إإكسبلنتس الدماغ مع استهداف إضاءة الليزر ومطابقة نظارات مرشح أثناء العملية. تقنية الموضحة في المختبر Electroporation للفي حد ذاته ينتج المراقبة البصرية جيدة نسبيا لاستهداف مناطق معينة من الدماغ. من خلال الجمع بين ذلك مع الإثارة ليزر علامات وراثية الفلورسنت وعلى القراءة من خلال نظارات مرشح تمرير الفرقة، والتي يمكن التقاط انبعاثات المسمى وراثيا الخلايا / نوى وصبغة الفلورسنت البحث عن المفقودين، يمكن للباحث زيادة كبيرة في دقة الحقن من خلال إيجاد مساحة من الاهتمام والسيطرة على الصبغة الانتشار / الامتصاص في منطقة الحقن بشكل أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تقنية الإضاءة الليزر يسمح لدراسة وظيفة neurocircuit التي قدمها الأقليمiding المعلومات حول نوع من الخلايا العصبية إسقاط لمنطقة معينة في الحالات التي يتم فيها ربط التعبير GFP لنوع الارسال التي أعربت عنها جزء من السكان من الخلايا العصبية.
من أجل تحديد بعض الخلايا العصبية (الصغرى) الدائرة، يجب على المرء أن يبدأ من خلال إيجاد المشاركين من مختلف الدوائر وقال، ونمط علاقتهم. من أي وقت مضى منذ تم تأسيس نشر الر حول neurofiber البحث عن المفقودين من خلال lesioning 1 مجموعة كبيرة ومتنوعة من تقنيات تتبع تشريحي عصبي. بعض هذه التقنيات يمكن تطبيقها في الأنسجة ثابتة بعد الوفاة 2-4، والبعض الآخر يعتمد على النقل النشط من الصبغة في الخلايا العصبية الحية، كما اكتشف في عام 1971 5-6. هذا الأخير يمكن أيضا تقسيم في مجموعتين التمييز بين أساليب الاستفادة من الوراء النشط (من منطقة حقن لمصدر إسقاط معينة، أي. وsomata من الخلايا العصبية التي يتم إسقاط لوقال المنطقة) وتقدمي النشط (من حقن المنطقة هدفا لإسقاط معينة، أي. التوقعات محور عصبي والمحطات محور عصبي من الخلايا العصبية المسماة) النقل. أيضا، في بعض الحالات هيئة تنظيم الاتصالاتيتم حقن مادة حدات خفض الانبعاثات المعتمدة في الحيوانات الحية التي ثم البقاء على قيد الحياة حقن عدة أيام أو أسابيع (في حقن الجسم الحي التتبع)، بينما في حالات أخرى يتم حقن العقول explanted واحتضان لعدة ساعات بعد الحقن في السائل النخاعي الاصطناعي (في المختبر حقن التتبع) .
في هذا البروتوكول وتعديلها موجود في المختبر تقنية Electroporation لل8/7 لتسمية somata والعمليات العصبية في تقدمي ورجعي تتبع التجارب باستخدام choleratoxin الوحيدات-B وtetramethylrhodamine ديكستران مثل المواد التعقب. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير علماء الأعصاب مع أداة فعالة لتتبع أنماط الاتصال بين الخلايا العصبية في الدماغ نوى مختلفة، مع الاستفادة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا المتاحة والمعدات البصرية الأساسية من أجل زيادة دقة استهداف خلال حقن التتبع. على الرغم من أن طريقة تقدمي والبحث عن المفقودين إلى الوراء باستخدامcholeratoxin وأمين ديكستران ومنها تقارن بها fluorescently المسمى ليست جديدة 13/9 (كما هو طريقة Electroporation لل، على سبيل المثال. هاس وآخرون. 14)، والجمع بين الحقن التتبع مع Electroporation للفي إعداد في المختبر التي تنطوي على كتل من أنسجة المخ تطور أكثر حداثة 7. ميزته الرئيسية على تقنيات تعقب الخلايا العصبية باستخدام نفس النوع من الأصباغ التتبع في الحيوانات الحية هي زيادة كثافة وضع العلامات، وذلك بسبب زيادة الكفاءة التي يتم اتخاذها الصبغة electroporated من قبل الخلايا العصبية. ميزة إضافية هي الفترة تقصير حضانة (مطلوب لنقل صبغ) وزيادة دقة المستهدف خلال حقن التتبع، لأن المجرب لديه المراقبة البصرية على المنطقة المستهدفة من الحقن. يعني هذا الأخير أيضا ما هو مطلوب أي معدات المجسم مكلفة للعثور على نواة أو الدماغ مجال الاهتمام.
لعديزيادة دوليا هو دقة الاستهداف، ونحن استغل خط الماوس المعدلة وراثيا، والذي يعبر عن GFP في حيوانية glycinergic لها من الخلايا العصبية 15 و المعدات البصرية الأساسية التي تتكون من مؤشر ليزر باليد من 405 نانومتر نظارات الطول الموجي ومطابقة الفرقة تمرير تصفية (450 – 700 نانومتر). وهكذا، حققنا المزيد من زيادة كبيرة في دقة الاستهداف عن طريق تحديد منطقة الحقن من خلال إشارته الفلورسنت، وتوفير وسيلة أدق للسيطرة على انتشار الصبغة داخل منطقة الحقن من خلال مراقبة التفاعل بين إشارة GFP الأصلية والتتبع مضان. كما يسمح لنا تقنية لكشف ظائف الدائرة جنبا إلى جنب مع الاتصال من خلال تحديد GFP إيجابية الخلايا العصبية المثبطة (أو مثير في خطوط الماوس الأخرى) التي كانت مليئة التتبع.
باختصار، نحن تعزيزه أداة قوية العلمية العصبية لدراسة connectome من الدماغ الفقاريات وتقييم رانه ميزات تشريحي عصبي مختلفة من neurocircuit معين. باستخدام الفئران المعدلة وراثيا إلى جانب المعدات البصرية مكلفة ومتاحة على نطاق واسع تمكنا من زيادة كبيرة في دقة استهداف حقن لدينا. وعلاوة على ذلك، فإن الفئران المعدلة وراثيا سمح لنا للتعرف على نوع من الاتصالات تتبعها، مما ساعد على كشف وظيفة لالمتناهية الصغر المثبطة في الدماغ السمعية.
A القوة العامة في المختبر التتبع Electroporation لل، خلافا لفي الدراسات المجراة البحث عن المفقودين، هو أنه يعطي الباحثين أفضل للوصول إلى منطقة الدماغ من الفائدة، وبالتالي، لا تنطوي على المجسم مكلفة (وغالبا الكهربية) المعدات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فترة بقاء اللاز?…
The authors have nothing to disclose.
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / أجريت NIDCD R01 DC التجارب 011582. التصوير في جامعة كولورادو أنشوتز الطبي الجامعي المتقدم المجهر الضوئي الأساسية بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة / NCRR كولورادو CTSI غرانت عدد UL1 RR025780 واضطرابات روكي ماونتن Neurlogical مركز الأساسية غرانت NIH P30NS048154. الدكتور ساشا دو لاك من معهد سالك قدم لنا مع الفئران GlyT2-GFP.
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
Potassium chloride | P9333 | ||
Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
Magnesium chloride | M2670 | ||
Calcium chloride | C5080 | ||
Glucose | G7528 | ||
Sodium bicarbonate | S6297 | ||
Ascorbic acid | A4544 | ||
Myo-inositol | I5125 | ||
Sodium pyruvate | P2256 | ||
Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
Agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
Perfusion setup | Custom-made | ||
Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |