Summary

Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC)

Published: December 24, 2015
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Summary

Las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC) aparecen cada vez más relevante para la aplicación clínica. El uso de un sistema de co-cultivo de MSCs y leucocitos de sangre periférica pre-manchado con la succinimidil éster colorante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), se describe la evaluación in vitro de MSC sobre la proliferación de leucocitos inmunomodulación efector y subpoblaciones específicas.

Abstract

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Introduction

Células madre mesenquimatosas humanas (MSCs) son progenitores somáticas que pueden diferenciarse en los linajes mesodérmicos paraxiales de hueso, cartílago, y tejido adiposo 1-4, así como a unos pocos linajes extramesodermal 5. En primer lugar aislado de la médula ósea de adultos, estos progenitores multilinaje ahora se han encontrado en numerosos tejidos y 6-8, de forma inesperada, que se muestra a tener fuertes propiedades inmunomoduladoras que aparecen altamente susceptibles a la aplicación clínica 9-12. Mecanismos detallados implicados en los efectos inmunomoduladores activamente están siendo investigados por la aplicación efectiva de entidades patológicas específicas. Una de las formas más sencillas para evaluar la inmunomodulación es mediante la evaluación para la supresión de la proliferación de leucocitos efector 13. La mayoría de los leucocitos efectoras tales como linfocitos y monocitos T proliferan prodigiosamente cuando es estimulado o activado. La función inmunomoduladora se puede evaluar cuando la supresión de laproliferación se evidencia.

Tradicionalmente, la proliferación de leucocitos efector ha sido evaluada por detección de [3 H] timidina en el ADN. Sin embargo, este método tiene inconvenientes significativos debido a las preocupaciones de la radiación y la post-uso disposición, así como el equipo complejo sea necesario. Si bien hay ensayos no radiactivos para evaluar la proliferación celular, el éster de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) de ensayo tiene otras ventajas tales como permitir que para la identificación de poblaciones celulares específicas, lo cual es especialmente útil en los experimentos de co-cultivo que implican múltiples tipos de células. CFSE es un colorante fluorescente celular que puede ser evaluado mediante análisis de citometría de flujo. Como las células se dividen, la intensidad de esta etiqueta celular se reduce proporcionalmente; Esto no sólo permite la determinación de la proliferación celular en general, pero también permite la evaluación del número de divisiones celulares hasta 8 divisiones antes de la fluorescencia se vuelve difícil en Detect contra la señal de fondo. Por otra parte, la estabilidad de la CFSE fluorescente permite el seguimiento in vivo de células marcadas tales que las células pueden ser visualizadas hasta muchos meses 14.

Este ensayo también se puede variar para evaluar tipos específicos de leucocitos efectoras o la función inmunomoduladora de las poblaciones específicas de MSC inducida por leucocitos-tales inmunomoduladores como la interleucina-10 (IL-10) que produce monocitos CD14 + 15 mediante la realización de talón marcador de selección superficie magnética del poblaciones de células de interés antes o después de co-cultivo según sea apropiado. Nuestro protocolo describe el ensayo básico de la evaluación de los efectos inmunomoduladores de MSCs en los leucocitos efectoras (diagrama de flujo mostrado pt la Figura 1) y una variación de este ensayo básico para la evaluación de la inducida por MSC inmunomodulación de leucocitos en alogénicas CD4 + efectoras linfocitos T (diagrama de flujo mostrado pt la Figura 4).

Protocol

El consentimiento informado del paciente aprobado por la junta de revisión institucional debe ser obtenido por el uso de las células humanas. 1. Densidad aislamiento degradado de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) Añadir 25 ml de sangre entera heparinizada en un tubo de 50 ml con una pipeta 25 ml. Diluir las células con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 15 ml de gradiente de densidad de Ficoll-Pa…

Representative Results

La Figura 1 indica el esquema general del experimento, y la Figura 2 muestra el aspecto de las distintas condiciones de cultivo celular como se visualizaron mediante contraste de fase invertida microscopía. MSCs son células adherentes con una fibroblástica, la morfología en forma de huso, mientras que PBMCs y leucocitos son pequeñas células no adherentes redondas. Estos dos tipos de células morfológicamente diferentes pueden verse claramente en el co-cultivo. Al final del ensayo, cu…

Discussion

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by grants from NHRI (CS-104-PP-06 to B.L.Y.).

Materials

Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 71-7167-00 AG Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) Life Technologies V12883 Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA) Sigma L8902 Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28 Life Technologies 111.32D Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells,etc.
autoMACS™ Separator Miltenyi Biotec autoMACS™ Separator Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns Miltenyi Biotec 130-021-101 separation columns
CD14 microbeads, human  Miltenyi Biotec 130-050-201 For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human  Miltenyi Biotec 130-045-101 For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium Life Technologies 11875 Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate Life Technologies 11885 Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine Life Technologies 25030-081 Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS) 1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) 1) SH30070.03M 2) 10091-148 Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate Corning COR3524 Co-culture plate
50 mL centrifuge tube Corning 430291 Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 mL centrifuge tube  Corning 430766 Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes BD Falcon  352008 Collection of cells for flow cytometric analysis

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Citar este artigo
Hsu, P., Liu, K., Chao, Y., Sytwu, H., Yen, B. L. Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs). J. Vis. Exp. (106), e53265, doi:10.3791/53265 (2015).

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