İnsan Mezenkimal Kök Hücre İmmünomodüler Properties (MKH) değerlendirilmesi
Summary
İnsan mezenkimal kök hücrelerin (MSC) immünomodülatör özellikleri, klinik uygulama için giderek daha önemli görünmektedir. Floresan boya carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) ile ön-lekeli MSC ve periferal kan lökositlerinin bir ko-kültür sistemi kullanılarak, efektör lökosit çoğalmasının ve spesifik alt popülasyonları MSC immünomodülasyon de vitro değerlendirme tarif eder.
Abstract
The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.
Introduction
İnsan mezenkimal kök hücreler (MKH) bir kaç extramesodermal soy 5 yanı sıra, kemik, kıkırdak ve yağ dokusunda 1-4 paraxial mezodermal soy içine ayırt edebilirsiniz somatik atalarıdır. İlk erişkin kemik iliğinden izole, bu mültilineaj atalarıdır artık klinik uygulama 9-12 için son derece müsait görünen güçlü bağışıklık düzenleyici özelliklere sahip oldukları gösterilmiştir, beklenmedik, çok sayıda dokularda 6-8 bulunabilir ve oylandı. Immünomodülatör etkileri katılan Detaylı mekanizmalar aktif spesifik hastalık varlıklar üzerinde etkili uygulama için araştırılmaktadır. Immünmodülasyonu değerlendirmek için en basit yollarından biri efektör lökosit çoğalması 13 bastırılması için değerlendirilmesi gereğidir. Uyarılmış ya da aktive olduğunda örneğin T lenfositler ve monositler gibi çoğu efektör lökositler müthiş eğlenir çoğalırlar. İmmünomodülatuar fonksiyonu değerlendirilebilir zaman bastırmaçoğalması kanıtlanmıştır.
Geleneksel olarak, efektör lökosit proliferasyonu DNA içine [3H] timidin eklenmesi saptanması ile değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, radyasyon ve kullanım sonrası imha endişelerine önemli dezavantajları, hem de gereken karmaşık bir ekipmana sahiptir. Hücre çoğalmasını değerlendirmek için radyoaktif olmayan tahliller olmakla birlikte, carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) deneyi gibi birçok hücre tipini içeren ko-kültür deneyleri özellikle yararlı olan, özel hücresel popülasyonlar, tanımlanması için izin verilmesi gibi başka avantajlara da sahiptir. CFSE, akış sitometrik analizi ile tespit edilebilir bir flüoresan hücre boyadır. Hücre bölünmeleri gibi, bu hücresel etiketin yoğunluğu orantılı azalır; Bu sadece genel hücre çoğalmasının tespitine imkan değil, aynı zamanda floresan det zorlaşır önce 8 tümen kadar hücre bölünmeleri sayısına değerlendirilmesi için izin verirEKT arka plan sinyali karşı. Ayrıca, flüoresan CFSE stabilitesi hücreleri aylarca 14 kadar görselleştirilebilir şekilde etiketlenmiş hücrelerin in vivo izlenmesi için izin verir.
Bu deney de efektör lökosit veya spesifik popülasyonlarının bağışıklık fonksiyonunun belirli türde değerlendirmek için değişik olabilir ve manyetik boncuk yüzey işaretleyici seçimi gerçekleştirerek bağışıklık lökosit-interlökin-10 (IL-10) üretilmesi, CD14 + monositleri 15 olarak MSC-kaynaklı önce veya uygun bir şekilde eş-kültür sonrası ilgi hücre popülasyonları. Bizim protokol (akış şeması gösterilmiştir (akış şeması Şekil 1 'de gösterildiği gibi) efektör lökositler üzerinde MSC immünomodülatör etkileri belirlemek temel deneyi ve allojenik CD4 + efektör T lemfositlerinin MSC-uyarılan lökosit immünomodülasyon değerlendirilmesi için bu temel tahlilinde bir değişik biçimi tarif edilmiştir Şekil 4'te).
Protocol
Representative Results
Discussion
Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.
One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from NHRI (CS-104-PP-06 to B.L.Y.).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells,etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
Referências
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
- Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
- Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
- Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
- Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
- Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , (2011).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
- Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I., Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. , 18.8.1-18.8.24 (2005).
- Phelan, M. C., Lawler, G., Robinson, J. P., et al. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. , A.3A.1-A.3A.4 (2001).
- Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
- Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
- Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties?. Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
- Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).
