La inmunotinción para visualizar murino entérica Desarrollo del Sistema Nervioso
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
Un funcionamiento del sistema nervioso entérico (ENS), que controla la motilidad, la absorción de nutrientes, y el flujo sanguíneo local, es esencial para la vida 1. El ENS está formado por células de la cresta neural (NCC) que proliferan, migran y colonizar el intestino, donde se diferencian en neuronas de los ganglios que contiene y células gliales. Enfermedad de Hirschsprung (herencia mendeliana HSCR, en línea en el hombre), un trastorno congénito multigeneic con una incidencia de 1 en 4.000 nacidos vivos, se puede considerar la enfermedad prototípico para el estudio de la formación de ENS interrumpido. En HSCR, NCC dejan de migrar y colonizar a longitudes variables del intestino posterior distal 2. Además, otra gastrointestinal común (GI) defectos en el desarrollo de la población pediátrica, como malformaciones anorrectales, atresias intestinales y trastornos de la motilidad se asocian con alteraciones en las funciones básicas de la ENS, y es probable que, asociados con cambios anatómicos subestimados sutiles y cambios funcionales enel 3-6 ENS. Por lo tanto, las técnicas que nos permitan comprender los determinantes del desarrollo de la formación ENS pueden arrojar luz sobre la patogénesis y el tratamiento potencial de trastornos del tracto GI pediátricos.
A raíz de la migración y colonización, NCC se diferencia en neuronas con marcadores específicos para su fenotipo neurotransmisor. Las neuronas colinérgicas representan aproximadamente el 60% de las neuronas entéricas 7, y pueden ser detectados por tinción para la colina acetiltransferasa (ChAT), la enzima sintetizadora de la acetilcolina del neurotransmisor excitatorio. Históricamente, los intentos de visualizar las neuronas colinérgicas fueron confundidos por los diferentes antígenos especificidad de anticuerpos dirigidos contra el sistema nervioso central (SNC) Chat contra el sistema nervioso periférico (SNP) Chat 8-10. Sin embargo, los anticuerpos dirigidos contra ChAT placentaria reconocer tanto ChAT central y periférico 11-13, y tenemos técnicas recientemente descritos que permiten visualización de las neuronas colinérgicas ENS con alta sensibilidad anteriormente en el desarrollo que se ha logrado con líneas reportero ChAT 14.
A continuación, presentamos una técnica de disección, la fijación y la inmunotinción de la murino tubo digestivo embrionario visualizar ENS expresión neurotransmisor en las neuronas. Para estos estudios, hemos utilizado ratones chat-Cre se aparearon con R26R: animales tdTomato para producir chat-Cre; R26R:: floxSTOP ratones tdTomato (definidos como Chat-Cre tdTomato todo el manuscrito): floxSTOP. Estos animales fueron entonces aparearon con ratones reportero GFP-ChAT homocigotos, para obtener ratones que expresan ambos reporteros fluorescentes que detectan la expresión de ChAT 14. Estos dos animales reportero están en un fondo C57BL / 6J y están disponibles comercialmente (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro laboratorio y otros han demostrado que los defectos intestinales en HSCR no se limitan al colon aganglionar pero extenderse proximalmente, incluso en el intestino delgado ganglionar 5,15,16. Estas alteraciones incluyen cambios en la densidad y ENS fenotipo neuronal neurotransmisor y puede dar cuenta de dismotilidad que se ha observado en pacientes con HSCR. Hemos utilizado las técnicas anteriores en nuestros esfuerzos para comprender los determinantes de la formación de la ENS. En concreto, estas t?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado byThe Premio American Pediatric Surgical Association Foundation (AG) y los Institutos Nacionales de Salud K08DK098271 (AG).
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
Referências
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