Immunfärbung zu Murine enterische Nervensystem Entwicklung visualisieren
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
Eine funktionierende enterische Nervensystem (ENS), der Motilität, Nährstoffaufnahme, und lokale Durchblutung steuert, ist lebens 1. Die ENS wird von Neuralleistenzellen (NCC), die Proliferation, Migration und besiedeln den Darm, wo sie in die Ganglien enthalten Neuronen und Gliazellen differenzieren gebildet. Hirschsprung-Krankheit (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), ein multigeneic angeborene Störung mit einer Inzidenz von 1 in 4.000 Lebendgeburten, kann als das prototypische Krankheiten für das Studium unterbrochen ENS Bildung werden. In HSCR, NCC nicht zu migrieren und zu kolonisieren variabler Länge des distalen Enddarm 2. Zusätzlich sind andere gemeinsame gastrointestinale (GI) Entwicklungsstörungen bei Kindern und Jugendlichen, wie anorektalen Fehlbildungen, Darmatresien und Motilitätsstörungen mit Störungen im Grund ENS Funktionen verbunden, und werden wahrscheinlich mit subtilen, unterschätzt, anatomischen Veränderungen und funktionelle Veränderungen in assoziiertdie ENS 3-6. Daher können Techniken, die uns, die Entwicklungs Determinanten der ENS Bildung verstehen lassen das Licht auf die Entstehung und mögliche Behandlung von GI-Trakt Erkrankungen pädiatrischen vergießen.
Nach der Migration und Besiedlung, unterscheidet NCC in Neuronen mit bestimmten für ihre Neurotransmitter-Phänotyp-Marker. Cholinergen Neuronen umfassen etwa 60% des enterischen Neuronen 7 und kann durch Färbung auf Cholinacetyltransferase (ChAT), dem synthetisierenden Enzyms zur exzitatorischen Neurotransmitter Acetylcholin nachgewiesen werden. Historisch versucht visualisieren cholinergen Neuronen wurden von unterschiedlichen Antigen-Spezifität von Antikörpern gegen das zentrale Nervensystem gerichtet verwechselt (CNS) ChAT gegen peripheren Nervensystem (PNS) ChAT 8-10. Jedoch Antikörper gegen Plazenta ChAT gerichtet erkennen sowohl zentrale und periphere ChAT 11-13, und wir haben vor kurzem beschriebenen Techniken, die für Visualisierungs ermöglichensierung von ENS cholinergen Neuronen mit hoher Empfindlichkeit früher in Entwicklung, als es mit Chat Reporter Linien 14 erreicht.
Hier präsentieren wir eine Technik zum Präparieren, Fixierung und Immunfärbung des murinen embryonalen GI-Trakt zu ENS Neurotransmitter Expression in Neuronen zu visualisieren. FloxSTOP:: tdTomato Tiere zu produzieren Chat Cre; R26R: Für diese Studien haben wir ChAT-Cre Mäusen mit R26R gepaart genutzt floxSTOP: tdTomato Mäusen (zB Chat-Cre tdTomato ganzen Manuskript definiert). Diese Tiere wurden dann mit homozygot ChAT-GFP-Reporter Mäusen gepaart, um Mäuse, die sowohl fluoreszierenden Reportern, dass ChAT Ausdruck 14 erkennen zu erhalten. Diese beiden Reporter Tiere sind auf einem C57BL / 6J Hintergrund und im Handel erhältlich (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
Labor und andere haben gezeigt, dass Darmfehlern HSCR sind nicht auf die aganglionären Kolon sogar ins ganglionated Dünndarm 5,15,16 beschränkt, sondern proximal verlängert. Diese Veränderungen umfassen Veränderungen der ENS neuronalen Dichte und Neurotransmitter-Phänotyp und können für Motilitätsstörungen, die bei Patienten mit HSCR beobachtet wurde, Rechnung zu tragen. Wir haben die oben genannten Techniken in unseren Bemühungen, die Determinanten der ENS Bildung verstehen genutzt. Insbesondere …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vonThe amerikanischen Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) und den National Institutes of Health K08DK098271 (AG) unterstützt.
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
Referências
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
