المناعية لتصور الفئران المعوية العصبي تطوير النظام
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
ويعمل الجهاز العصبي المعوي (ENS) التي تسيطر على الحركة، وامتصاص المواد الغذائية، وتدفق الدم المحلي، أمر ضروري في الحياة 1. يتم تشكيل ENS من قبل خلايا قمة العصبية (NCC) التي تتكاثر، الهجرة واستعمار القناة الهضمية، حيث تفرق في العقد تحتوي على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. مرض هيرشسبرونغ (HSCR، الانترنت وراثة مندلية في مان)، وهو اضطراب خلقي multigeneic مع حدوث 1 في 4000 ولادة حية، يمكن اعتبار المرض prototypic لدراسة تشكيل ENS تعطلت. في HSCR، NCC تفشل في الهجرة إلى استعمار وأطوال مختلفة بين المعى المؤخر القاصي 2. بالإضافة إلى ذلك، ترتبط الجهاز الهضمي المشتركة الأخرى (GI) وجود عيوب التنموية في عدد من الأطفال، مثل التشوهات الشرجية، atresias المعوية، واضطرابات الحركة مع اضطرابات في وظائف ENS الأساسية، وعلى الأرجح يرتبط خفية، لا تقدر حق قدرها، والتغيرات التشريحية وتغييرات وظيفية في3-6 ENS. لذلك، قد التقنيات التي تسمح لنا لفهم المحددات التنموية لتشكيل ENS تسليط الضوء على المرضية والعلاج المحتملة للاضطرابات الجهاز الهضمي للأطفال.
وبعد الهجرة والاستعمار، NCC يفرق في الخلايا العصبية مع علامات محددة لالنمط الظاهري العصبي بهم. تتكون الخلايا العصبية كوليني ما يقرب من 60٪ من الخلايا العصبية المعوية 7، ويمكن الكشف عنها بواسطة تلطيخ للأسيتيل كولين (الدردشة)، الانزيم توليف لالناقل العصبي الأسيتيل كولين مثير. تاريخيا، يحاول تصور ومرتبك الخلايا العصبية الكوليني التي كتبها اختلاف مستضد خصوصية الأجسام المضادة الموجهة ضد النظام العصبي المركزي (CNS) دردشة مقابل الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) دردشة 8-10. ومع ذلك، الأجسام المضادة الموجهة ضد المشيمة دردشة تعترف كل من دردشة المركزية والطرفية 11-13، ولدينا تقنيات وصفها مؤخرا التي تسمح للvisualization من ENS الخلايا العصبية الكوليني مع حساسية عالية في التنمية في وقت سابق من تحقق مع خطوط مراسل دردشة 14.
هنا، نقدم تقنية لتشريح، وتحديد والمناعية من الفئران الجنينية GI الجهاز لتصور ENS العصبي التعبير في الخلايا العصبية. لهذه الدراسات، ولقد استخدمت الفئران دردشة لجنة المساواة العرقية تزاوج مع R26R: الحيوانات tdTomato لإنتاج دردشة لجنة المساواة العرقية؛ R26R: floxSTOP الفئران tdTomato (كما هو موضح دردشة لجنة المساواة العرقية tdTomato في جميع أنحاء المخطوط): floxSTOP. ثم تم تزاوج هذه الحيوانات مع متماثل الفئران مراسل دردشة GFP، للحصول على الفئران التعبير عن كل صحفيين الفلورسنت التي تكشف عن التعبير دردشة 14. هذه الحيوانات مراسل هما على خلفية C57BL / 6J ومتاحة تجاريا (مختبرات جاكسون، بار هاربور، ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت مختبرنا وغيرها من الجهات التي عيوب المعوية في HSCR لا تقتصر على القولون بانعدام العقد ولكن تمديد قريب، حتى في الأمعاء الدقيقة عقدي 5،15،16. وتشمل هذه التغيرات تغيرات في الخلايا العصبية ENS الكثافة والعصبي النمط الظاهري وربما تمثل dysmotility التي لوحظت في المرض…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل أعد الصورة جائزة طب الأطفال الأمريكية الجراحية جمعية مؤسسة (AG) والمعاهد الوطنية للصحة K08DK098271 (AG).
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
Referências
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
