Summary

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

Published: December 01, 2014
doi:

Summary

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Abstract

שרשרת כבדה (IGH) רקומבינציה אימונוגלובולין הלימפוציטים B מתג כיתה (CSR) היא תהליך שבו הביע תחילה IgM עובר לisotypes IGH האחר, כגון IgA, IgE וIgG. מדידה של IGH CSR במבחנה היא שיטת מפתח למחקר של מספר תהליכים הביולוגיים הנעים בין רקומבינציה DNA ותיקון להיבטים של אימונולוגיה מולקולרית ותאית. Assay במבחנה CSR כרוך ביטוי איג משטח מדידת הזרימה cytometric על תאי B מופעלים. בעוד מדידת subclasses IgA וIgG היא פשוטה, המדידה של IgE בשיטה זו היא בעייתית בשל IgE המסיס מחייב FcεRII / CD23 הביע על פני השטח של תאי B מופעלים. כאן אנו מתארים הליך ייחודי למדידה מדויקת של IgE-ייצור B עכבר תאים שעברו אחריות חברתית בתרבות. השיטה מבוססת על מחשוף בתיווך טריפסין של מתחמי IgE-CD23 על משטחי תא, ומאפשרת לגילוי של IgE-ייצור תאי B שושלת ידי CYצביעת toplasmic. הליך זה מציע פתרון נוח לניתוח הזרימה cytometric של CSR לIgE.

Introduction

במהלך שרשרת כבדה רקומבינציה אימונוגלובולינים (IGH) מתג כיתה (CSR) בעכברים ובבני אדם, IGH μ אקסונים קבועים אזור (Cμ) יימחקו ויוחלפו על ידי אחד מכמה סטים של אקסונים אזור קבועים במורד הזרם (ים H C) (למשל Cγ, Cε, וCα), וכתוצאה מכך מתג מייצור IgM לייצור של מעמדות אחרות איג (למשל IgG, IgE, או IgA). CSR מתרחש בתוך אזורי מתג (S), שהם 1-10 רצפי kb ממוקמים 5 'לכל קבוצה של C H של 1. אנזים ההפעלה-induced Cytidine deaminase (AID) יוזם אחריות חברתית באמצעות פעילות דיאמינציה cytidine.

IgE הוא מתווך עיקרי של מחלה אלרגית 2 והבנה טובה יותר של איך IgE מיוצר ומוסדר עשוי לפתוח דלתות לגישות טיפוליות חדשות למחלה אטופית. בעכברים ובבני אדם, IgE הוא אלוטיפ איג המוסדר ביותר בחוזקה. IgE בדרך כלל מתגלה באלפי רמות של times פחות מIGH האחר isotypes 3, אבל יכול להיות מורמים מאוד במצבי מחלה 4. עם זאת, אחריות חברתית לIgE הוא הבין באופן חלקי. הפעלה במבחנה של תאי B באמצעות IL-4 בשילוב עם שני אנטי CD40 או LPS, גורם לשני CSR IgG1 וIgE 5. תאי B מופעלים לבטא את קולט הנמוך זיקת IgE FcεRII / CD23 2,6, אשר נקשר IgE המסיס מופרש בתרבות לאחר CSR. לכן בעת ניתוח עם זרימת cytometry, תאי B עם כתם IgE-מחויב קולט בדומה לתאי B אופן אנדוגני להביע 7 IgE. אמנם ידוע כי B עכבר תאים לבטא את הזיקה הנמוכה IgG קולט FcγRIIB1 (CD32) 8, בניסיון שלנו זה לא מופיע להפריע למדידה של מיתוג בכיתה לIgG1. עם זאת, בעת מדידת מיתוג IgE לאחר הפעלת תא B בתרבות, IgE מחויב-פני השטח ספציפיים עלול לטשטש את הניתוח. עם שיטות צביעה משותפות, תאים שאינם IgE להביע להכתים חיובי עבור IgE.

מתואר כאן היא אסטרטגיה שנוצלה לביצוע מבחני אחריות חברתית ולזהות תאי B להביע IgE אמיתיים מעכברים 9-11. טיפול בתאי B מופעלים עם טריפסין, מגיב מעבדה משותפת לעיכול חלבון, מסיר משטח מחויב שני cytophylic וקרום IgE. permeabilization לאחר והצביעה לIgE cytoplasmic כך חושפים את התאים מייצרי IgE האמיתיים.

Protocol

הערה: כל הניסויים שתוארו כאן היו בהתאם להנחיות ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) ואושרה על ידי בית החולים לבעלי חיים למחקר לילדים (קשת), בוסטון, מסצ'וסטס. 1. הכנת ריאגנטים בורסת 1,000x IL…

Representative Results

הליך זה יושם בהצלחה ללמוד CSR לIgE בB עכבר תאים. כדי להדגים את היעילות במדידת CSR, אנחנו מגורה תאי B טחול עכבר עם אנטי CD40 וIL-4 כפי שתואר לעיל 11. לאחר חמישה ימים של גירוי, תאים נאספו ועובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל ומוכתם עם fluorescently שכותרתו IgM, IgG1, IgE, וB220 נוגדנים (CD45R). מ?…

Discussion

גירוי של תאי B טחול עכבר בתרבות עם אנטי CD40 וIL-4 יהיה לדמות סוג T מסייע 2 (T H 2) אינטראקציות, מיתוג כיתה מעודד לIgG1 וIgE 5. תאי B יכולים להיות מופעלים על אחריות חברתית בהקשר של splenocytes הכולל של 12 או תאי B טחול מטוהרים 11. כפי שצוין בפרוטוקול (שלב 2.3), העשרת תאי B…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DRW נתמך על ידי מענקי NIH AI089972 וAI113217, ועל ידי הרירי אימונולוגיה מחקרי צוות, ופרס קריירה עבור מדענים רפואיים מWellcome בורוז הקרן מחזיק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse IgE FITC BD Pharmingen 553415 clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PE BD Pharmingen 550083 clone A85-1
Methanol BDH BDH1135-4LP Keep at -20 °C
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon Corning 352340
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon Corning 352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-4052-82 clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40 eBioscience 16-0402-85 clone HM40-3
RPMI Medium 1640 Gibco 11875-093
HEPES (1M) Gibco 15630-080
MEM-NEAA (100X) Gibco 11140-050
Phosphate Buffered Saline (10X) Lifetechnologies (Corning) 46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbeads  Miltenyi Biotec 130-049-501
MACS purification column Miltenyi Biotec 130-042-401
IL-4 PeproTech 214-14 Reconstitute in water or 0.1% BSA
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128-4L
Trypsin-EDTA Solution (10X) Sigma Aldrich T4174-100mL 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P0781-100mL 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)
L-Glutamine 200mM Sigma Aldrich G7513
2-mercaptoethanol (99%) Sigma Aldrich M6250-100mL
Red cell lysis buffer Sigma Aldrich R7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 SouthernBiotech 1140-17 clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum Thermo SH30910.03
B cell Stimulation media B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,  1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL)

Referências

  1. Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
  2. Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
  3. Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. . Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
  4. Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
  5. Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
  6. Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
  8. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
  9. Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
  10. Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
  11. Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
  12. Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
  13. Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
  14. Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).
  15. Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
  16. Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
  17. Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
  18. Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
  19. Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
  20. Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
  21. He, J. -. S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
  22. Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).

Play Video

Citar este artigo
Gallagher, M. P., Shrestha, A., Magee, J. M., Wesemann, D. R. Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells. J. Vis. Exp. (94), e52264, doi:10.3791/52264 (2014).

View Video