Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.
ギブソン·アセンブリ(GA)クローニングは、従来のDNAクローニング方法に、迅速で信頼性が高く、柔軟な代替手段を提供しています。我々は、マウス胚性幹細胞(たmESC)における外来遺伝子の発現のためのカスタマイズされたプラスミドを作成するためにGAを用いた。 SV40またはヒトサイトメガロウイルスプロモーターの制御下にある外来遺伝子の発現は、たmESCへのトランスフェクションの後にすぐに減少する。この減少した発現のための治療薬は、遺伝子発現を駆動するために、ヒト伸長因子1α(HEF1α)プロモーターを使用することである。 HEF1αを含むプラスミドベクターは、SV40-またはCMV-含むプラスミド、特にも含むN末端3xFLAGタグなどとして広く利用可能ではありません。ここで説明するプロトコルは、HEF1αプロモーターの表情調節下FLAGタグCstF-64とCstF-64変異体を発現するプラスミドを作成するための迅速な方法である。 GAは、可能なDNA断片の末端の重複クローニングを行うためにDNAエキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼのブレンドを使用する。私たちが利用できる持っていた鋳型DNAに基づいて、我々は我々の構築物は、単一のシーケンスに組み立てられるように設計されています。をpcDNA 3.1ベクター骨格、HEF1αプロモーターパート1、(二本鎖合成DNA断片として購入3xFLAGタグを含まれている)に従えば容易プロモーター部2、及びCstF-64または特定CstF-64のどちらかの変異体:私たちのデザインは、4つのDNA断片を使用していました。これらのフラグメントの配列は、DNA断片を生成するための適切なPCRプライマーを設計するためのプライマー生成ツールにアップロードされた。 PCR後、DNA断片は、選択マーカーを含むベクターと混合し、GAクローニング反応を組み立てた。個々の形質転換された細菌コロニーからプラスミドを単離した。プラスミドの初期画面は、配列決定に続いて、制限酵素消化によって行った。結論として、GAは、私たちは画面と検証を構築するなど、5日間での遺伝子発現のためにカスタマイズされたプラスミドを作成することができました。
従来のDNAクローニング方法は、一緒にDNA断片を結合するためにDNAリガーゼとDNAを切断する制限酵素の使用に依存している。異なるDNA断片を含むカスタム発現構築物の生成は、一または複数の制限エンドヌクレアーゼおよびライゲーションを介してDNA断片の挿入に続くDNAの切断を含むシーケンシャルな手順である。この方法の主な欠点は、DNA断片のいずれかの適当な制限酵素は不可能関心の全長タンパク質の正常なDNAのクローニングをレンダリング( すなわち、いくつかの切断部位を有し得る)を識別することは困難かもしれないということである。そのため、カスタム式の生成は、カスタマイズタンパク質タグを用いる効率的な細胞型特異的プロモーターの転写調節下の構築物は、非常に慎重な設計が必要です。また、時間と労力のかかる手法である。最近では、いくつかの報告がmultipを組み立てるための方法論を説明した連続したシーケンスでル異なる合成DNA断片のいずれか一次元または二段反応で同時に制限を使用することなく1-3酵素 。ワンステップクローニング反応(すべての準備ステップを除く)は、DNAエキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ2,3及びDNA断片の重複端部( 図1)の混合物の使用に依存する。制限酵素の無駄がないので、(高度に反復配列を除く)任意のサイズおよび配列組成のDNA断片は、シームレス構造物で一緒に融合することができる。最近では、市販のキット(ギブソンアセンブリと、GA)ワンステップクローニング反応のために利用できるようになった。このキットは、カスタマイズされたプロモーターおよびタンパク質タグを有する単一のベクター内の任意のDNA断片の迅速かつ費用効率的な組み立てを可能にする。
哺乳動物細胞培養モデルにおいて外因性タンパク質を発現させるために使用広く入手可能なプラスミド発現ベクターは、転写regの下にあることが多いウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)またはシミアンウイルス40(SV40)プロモーターのulation。これらのウイルスプロモーターは、哺乳動物細胞培養ベースのモデルの大部分において外因性タンパク質の強固な一過性発現を提供する。しかし、安定して外因性タンパク質を発現する細胞株の生成が原因確立プロセス4,5の間にCMVまたはSV40プロモーターの転写サイレンシングがしばしば成功しない。また、SV40およびCMVウイルスプロモーターが十分6,7リンパ系統または胚性幹細胞由来の細胞における外因性タンパク質の発現を促進しない。ウイルスプロモーターの固有の制限を解決するには、強力な構成非ウイルスプロモーター8-10を使用することです。ヒト由来の1つのよく特徴付け強力な構成の非ウイルスプロモーターは、伸長因子1α(HEF1α)プロモーター(HEF1αがリボソーム11にアミノアシルtRNAのGTP依存関連の触媒作用に関与している)である。しかし、HEF1αプロモーターを含む発現ベクターは、特にものはまた、目的のタンパク質のアミノ末端に3×FLAGを含むプラスミドを含むウイルスプロモーターとして広く利用できない。
64000 MW切断刺激因子タンパク質(CstF-64)は、複製依存ヒストンmRNAを14,15を含むほとんどのmRNA 12,13の3 '末端プロセシングに関与している。 CstF-64は、すべての体細胞組織12で表されます。そのRNA認識モチーフは、切断およびポリアデニルサイト16の下流新生転写上のGUリッチRNA配列に結合する。 CstF-64 mRNA前駆体への結合はこれが新生転写物の効率的なエンドヌクレアーゼ的切断を促進する。
ここでは、プロトコルは、3xFLAGタグ化メートルのカスタムベクトルを生成するためにDNAフラグメントのPCR増幅、(化学的コンピテント細菌細胞を含む)ギブソン·アセンブリクローニングキットを使用して、記載されているウーズCstF-64または変異CstF-64HEF1αプロモーター1の発現下でのアミノ末端まで。
GAクローニングの成功した使用は、常に完全な構築物( 図2と図3)の注意深い設計が先行されるべきである。
プライマー生成ツールによって設計されたプライマー配列の慎重な検証も強くお勧めします。 GAのためのプライマーは、プライマー生成ツールを使用せずに生成されてもよい。しかし、ツールの使用は、プロセスを簡素化しているため非常にお勧めです。一般的に、GAクローニングのためのプライマーは、2つの機能的に異なる配列を持っている必要があります。第一の配列は、DNA断片特異的であり、PCRを用いて、断片の増幅を可能にする。第二の配列は、GAアセンブリのために必要である隣接フラグメント、と重なっている。典型的なDNA断片特異的配列の長さは18〜22 ntのだろう。同じDNAを増幅するために使用したDNA断片の特定の配列は、類似の融解温度及びGC含量を持っている必要があります。重複配列は、15の少なくともあるべきである塩基、少なくとも48℃の融解温度を有する、長さ。 4つ以上のDNAフラグメントのアセンブリは、少なくとも20塩基であることが重複配列を必要とする。長い重複がより適切に組み立てられたDNA断片をもたらしアニーリングの特異性の増加が可能になります。それは、歪んだ配列は、適切なDNAアセンブリを損なう可能性があるため、彼らのGCまたは重複配列を開発する上でコンテンツATスキューされる配列を避けることをお勧めします。
また、単にDNA断片はGA反応においてベクター骨格に対応する、任意の薬剤耐性細菌コロニーを生成するべきでない、ネガティブコントロールとして使用して示唆している。あるいは、「挿入」を含むDNA断片のいずれもない薬剤耐性細菌コロニーを生じるはずであるGA反応から省略され得る。はコロニーが成長しません理由はCOMPLの組み立てをレンダリングします隣接するDNA断片の重複両端の欠如、となりますETEプラスミド。
プロトコルにおいてプライマーセットを生成するためのnt 25の重複配列、記載があるため( 図3)を使用したDNA断片の数、使用された。 6 DNAフラグメント-プライマー生成ツールウェブサイトの推薦4を組み立てるためには、少なくとも20塩基の重複配列を使用することである( 機器の表を参照)。また、長いDNA鎖の適切な相補性を確保する重複配列を正確に組み立てられた製品の数を増加させる( 図1参照)。
現在、シームレスクローニングするためのいくつかのシステムが利用可能です。しかしながら、これらのシステムのいくつかは、まだ( すなわち、ゴールデンゲート18をクローニング)制限酵素を使用。他のものは、同一の生物学的供給源19からのワクシニアウイルスDNAポリメラーゼおよび一本鎖DNA結合タンパク質に基づく酵素の独自のブレンドを使用する。両方のシステムは、ショアによりGAに比べて限定されている重複配列のTERの長さ。短い重複配列が問題のある23以上のDNA断片の適切なアセンブリをレンダリングする、隣接するDNA断片のアニーリング工程に十分な特異性を提供しない可能性があるため。これらの欠点は、GAシステムには存在しない。
(長さ、すなわち、8未満kbpの)PCRにより確実に増幅可能な大きさを超えないように、増幅されるDNA断片の大きさも考慮されるべきである。でも、過去10年間におけるDNAポリメラーゼの機能の改善で、大きなDNA断片は、以下の効率および精度で増幅される。必要に応じて、より大きなDNAフラグメントは、プラスミド単離および制限酵素による適切なDNA消化により、例えば PCRに代わる他のソースから得られるであろう。具体的には、PCRを使用して私たちの合理的な現在の原稿に記載されているプロトコル、すべての未満であった利用可能なDNA断片の大きさに基づいていた5 kbpの。アガロースゲル電気泳動によって同定し、複数のPCR産物が存在する場合、望ましい断片サイズのゲル精製は、利用可能な分子生物学の技法または適切なキットのいずれかを使用して推奨される。現在のプロトコルでは、熱安定性DNAポリメラーゼは、( 材料の表を参照)が使用される。しかし、高い忠実度および収率を提供する任意のDNAポリメラーゼは、このプロトコルで使用するのに適しているであろう。プロトコールに記載さとは異なる高忠実度DNAポリメラーゼが利用可能な場合は、それぞれのマニュアルに記載されているように、セットアップ条件を使用しています。現在のプロトコルでは、化学的にコンピテントE. coli細胞を、GAキットに付属しているが使用される。また、化学的または電気コンピテントE.そのようなDH5α又はDH10Bなどの大腸菌株を使用することができる。
2Xマスターミックスをクローニングアセンブリは、最小限のハンズオンタイムで使いやすいです。しかし、正確なピペッティングは、NEが小さいため、ボリュームが要求される一緒に混合するeded。良好な分子生物学技術は、同様に、常に注意が必要である。
GAのクローニングは、サイズが3 kbpのより長いDNA断片、プラスミドおよびベクターの構築のための無限の可能性を提供しています。それは例えば、全体の細菌( マイコプラズマ·ミコイデス )ゲノムまたは酵母(サッカロミセス·セレビシエ)染色体20,21の合成およびアセンブリを可能にするため、また、それは、合成生物学の分野において広範な影響を有する。技術はまた、シームレスな構築物を生成する従来のクローニングニーズに適用可能である。
結論として、GAのクローニングは、従来のDNAクローニング手順に、迅速な信頼性と柔軟な代替手段を提供しています。
The authors have nothing to disclose.
我々は気前よく提供するpcDNA 3.1 MYC-彼の(A)とHEF1αプロモーターを含むプラスミドについて、テキサス工科大学健康科学センター、ラボック、テキサス州とムラデンYovchevピッツバーグ大学医療センターでは、ピッツバーグでのPAをミカエラヤンセンに感謝したいと思います。この出版物で報告された研究は、受賞番号(CCM)はR01HD037109の下で成育医療国立衛生研究所の人間開発のユーニス·ケネディ·シュライバー国立研究所によってサポートされていました。追加のサポートは、女性の健康のためにローラ·W·ブッシュ研究所(CCMおよびPNG)であった。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification system |
Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
NheI | New England BioLabs | R3131S | |
NotI | New England BioLabs | R3189S | |
HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |