Генерация плазмидных векторов выражая флага меченных белков соответствии с Положением удлинения Человеческий фактор-1α промотора, используя Gibson Ассамблею
Summary
Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.
Abstract
Гибсон в сборе (GA) клонирование предлагает быстрый, надежный и гибкую альтернативу традиционным методам клонирования ДНК. Мы использовали GA, чтобы создать индивидуальные плазмиды для экспрессии экзогенных генов в мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs). Выражение экзогенных генов под контролем промоторов SV40 или цитомегаловируса человека быстро уменьшается после трансфекции в mESCs. Средство для этого уменьшенного выражения использовать человеческий фактор элонгации-1 альфа (hEF1α) промотор для управления экспрессией гена. Плазмидные векторы, содержащие hEF1α не так широко доступны, как SV40- или ЦМВ, содержащие плазмиды, особенно те, содержащих также N-концевых 3xFLAG-тегов. Протокол, описанный здесь метод ускоренного создания плазмиды, экспрессирующие FLAG-меченого CstF-64 и CstF-64 мутант под экспрессивного регулирования промотора hEF1α. А. использует смесь экзонуклеазы ДНК, ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы, чтобы клонирование перекрытия концы фрагментов ДНК возможных.На основе шаблона ДНК мы имели в наличии, мы разработали наши конструкции должны быть собраны в одной последовательности. Наш дизайн используется четыре фрагмента ДНК: pcDNA 3,1 вектор позвоночника, hEF1α промоутер часть 1, hEF1α промоутер часть 2 (в котором содержится 3xFLAG-тег, закупаемые в качестве синтетического фрагмента двухцепочечной ДНК), и либо CstF-64 или конкретных CstF-64 мутант. Последовательности этих фрагментов были загружены в генерации инструмента праймера для разработки соответствующих ПЦР-праймеров для генерации фрагментов ДНК. После ПЦР ДНК-фрагменты смешивали с вектором, содержащим селективный маркер и реакцию клонирования GA была собрана. Плазмиды из отдельных трансформированных бактериальных колоний были выделены. Начальный экран плазмид было сделано рестрикцией, а затем путем секвенирования. В заключение, GA позволили нам создать индивидуальные плазмиды для экспрессии генов в 5 дней, в том числе построить экраны и проверки.
Introduction
Обычные процедуры клонирования ДНК, основаны на использовании ферментов рестрикции расщеплять ДНК и ДНК-лигазы для соединения фрагментов ДНК друг с другом. Генерация пользовательских экспрессирующие конструкции, содержащие различные фрагменты ДНК является последовательная процедура, которая включает расщепление ДНК с одним и / или нескольких рестрикционных эндонуклеаз и последующей вставки ДНК фрагментов через лигирования. Основным недостатком этой процедуры является то, что подходящие ферменты рестрикции для одного из фрагментов ДНК может быть трудно определить (т.е., может иметь несколько сайтов расщепления) оказание успешном клонировании ДНК полной длины, представляющего интерес белка невозможно. Таким образом, поколение пользовательского выражения строит под регуляции транскрипции типоспецифических промоутеров эффективной камеры с настраиваемыми белка-тегов требует очень тщательной проработки. Это также времени и трудоемкая техника. В последнее время несколько сообщений описано методологии, чтобы собрать MULTIPле различные фрагменты синтетической ДНК в непрерывной последовательности, в то же время ни в одном одно- или двухступенчатых реакций без использования ферментов рестрикции 1-3. Один шаг клонирования реакции (за исключением все подготовительные шаги), в зависимости от использования смеси экзонуклеазы ДНК, ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы 2,3 и перекрывающиеся концы фрагментов ДНК (рисунок 1). Поскольку нет использование ферментов рестрикции, ДНК-фрагменты любого размера и состава последовательностей (за исключением высокой повторяющихся последовательностей) могут быть слиты вместе в бесшовной конструкции. Недавно коммерческого набора (Gibson сборка; GA) для одноступенчатых клонирования реакций стали доступны. Этот комплект позволяет быстро и экономически эффективной сборки любых фрагментов ДНК в одном векторе с настраиваемыми промоутеров и белковых меток.
Широко доступные векторы экспрессии плазмиды, используемые для экспрессии экзогенных белков в млекопитающих моделей клеточных культур часто находятся под транскрипции облавляет вирусного цитомегаловирус (ЦМВ) или обезьяньего вируса 40 (SV40) промоутеров. Эти вирусные промоторы обеспечивают надежную временную экспрессию экзогенных белков в большинстве млекопитающих моделей, основанных на клеточных культурах. Тем не менее, образование клеточных линий, стабильно экспрессирующих экзогенных белков часто безуспешными из-транскрипционного молчания в CMV или SV40 промоторы в процессе установления 4,5. Кроме того, SV40 и вирусные промоторы CMV не будет в достаточной степени способствуют экспрессии экзогенных белков в клетки из лимфоидной линии или эмбриональных стволовых клеток 6,7. Решение присущего ограничения вирусных промоторов использовать сильные учредительные без вирусные промоторы 8-10. Одним из хорошо характеризуется сильного конститутивного невирусных промотор человеческого происхождения является фактор элонгации 1α (hEF1α) промотор (hEF1α участвует в катализе GTP-зависимой ассоциации аминоацил-тРНК на рибосомах 11). Тем не менее,экспрессирующие векторы, содержащие промотор hEF1α не так широко доступны, как вирусного промотора, содержащего плазмиды, в особенности те, также содержащий 3 × флаг на концевой аминогруппой белка, представляющего интерес.
Коэффициент стимуляции расщепления 64000 МВт белка (CstF-64) принимает участие в конечной обработки 3'большинстве мРНК 12,13, включая репликации в зависимости от гистонов мРНК 14,15. CstF-64 экспрессируется во всех соматических тканей 12. Его мотив признания РНК связывается с ГУ-богатых последовательностей РНК на зарождающихся транскриптов ниже по течению от расщепления и полиаденилирования сайте 16. Это связывание CstF-64 к пре-мРНК способствует эффективному эндонуклеолитическим расщепление зарождающейся стенограмму.
Здесь протокол описан, который использует ПЦР-амплификации ДНК-фрагментов, Gibson сборки Cloning Kit (который включает в себя химически компетентных бактериальных клеток) для получения пользовательских векторов 3xFLAG-меченой мУЗ CstF-64 или мутант CstF-64 их амино-конце под выражением hEF1α промотора 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешное использование Г.А. клонирования следует всегда предшествует тщательное проектирование полного конструкции (рис 2 и рис 3).
Тщательной проверки последовательности праймеров, разработанных с помощью инструмента грунтовки поколения также настоятельно рекомендуется. Праймеры для GA может быть сформирован без использования инструмента праймера поколения. Тем не менее, использование инструмента рекомендуем, потому что это упрощает процесс. Как правило, праймер для клонирования А. должны быть две функционально различные последовательности. Первая последовательность представляет собой ДНК-фрагмент конкретно, и позволяет амплификацию фрагмента с помощью ПЦР. Вторая последовательность перекрывается с соседним фрагментом, который является необходимым для GA сборки. Типичная последовательность ДНК-фрагмента конкретных бы 18-22 нуклеотидов в длину. Специфические последовательности ДНК-фрагмент, используемые для амплификации ДНК тот же должны иметь одинаковые температуры плавления и содержание GC. Перекрытие последовательность должна быть по крайней мере 15NT в длину с температурой плавления не менее 48 ° С. Сборка более 4 фрагментов ДНК потребует перекрытия последовательность, по крайней мере 20 нуклеотидов. Более длинные перекрытия позволит повышенную специфичность отжига, в результате чего более правильно собранных фрагментов ДНК. Рекомендуется, чтобы избежать последовательности, которые менялись в их GC или при содержании в разработке перекрывающихся последовательностей, так как перекос последовательности может поставить под угрозу качественную сборку ДНК.
Мы также предлагаем использовать в качестве отрицательного контроля, который не должен производить какие-либо лекарственной устойчивостью бактериальных колоний, только фрагмент ДНК, соответствующий векторной позвоночника в реакции GA. Кроме того, один из фрагментов ДНК, содержащих "вставки" может быть опущено из реакции А., который также должен привести к отсутствию устойчивых к лекарствам колоний бактерий. Причина не колонии не будет расти будет отсутствие перекрывающихся концах соседних фрагментов ДНК, которые будут оказывать сборку комплете плазмиды.
В протокол, описанный, перекрывая последовательности 25 нт для создания были использованы наборы праймеров, из-за количества фрагментов ДНК, используемых (рисунок 3). Рекомендация веб-сайте инструмента грунт поколения (табл оборудования) является использование по крайней мере, 20 нт перекрывающихся последовательностей, чтобы собрать 4 – 6 фрагментов ДНК. Кроме того, более длинной последовательности перекрытия будет обеспечивать надлежащее комплементацию из цепей ДНК (рис 1) увеличение числа точно собранных продуктов.
В настоящее время, несколько систем для бесшовных клонирования доступны. Тем не менее, некоторые из этих систем все еще используют ферменты рестрикции (т.е. Golden Gate клонирования 18). Другие используют собственные смеси ферментов на основе вируса коровьей оспы ДНК-полимеразы и одноцепочечной ДНК-связывающего белка из той же биологического источника 19. Обе системы ограничены по сравнению с ГА по ШоруДлина тер перекрывающихся последовательностей. Поскольку короткие перекрывающиеся последовательности не может обеспечить достаточную специфичность отжига стадии смежных фрагментов ДНК, что делает правильную сборку более 23 фрагментов ДНК проблематичным. Эти недостатки отсутствуют в системе GA.
Размер фрагментов ДНК, подлежащей амплификации, должны быть также рассмотрены, чтобы не превышать размер надежно укрупнения с помощью ПЦР (т.е. менее 8 кб в длину). Даже с улучшением функции ДНК-полимераз в течение последних 10 лет, большие ДНК-фрагменты будут усилены с меньшей эффективностью и точностью. При необходимости, более крупные фрагменты ДНК могут быть получены из других источников альтернативных ПЦР, например, путем выделения плазмид и соответствующего пищеварения ДНК ферментами рестрикции. В частности, для протокола, описанного в текущем рукописи, наш рационально использовать ПЦР в зависимости от размера имеющихся фрагментов ДНК, которые были все менее5 кб. Если есть более чем один продукт ПЦР идентифицированы с помощью электрофореза в агарозном геле, очистка гель желаемого размера фрагмента рекомендуется использовать любой из доступных методов молекулярной биологии или соответствующих наборов. В текущем протокола используется термостабильной ДНК-полимеразы (см таблицу материалов). Однако ни ДНК-полимераза обеспечивает высокую точность и выход будет пригоден для использования с этим протоколом. Если высококачественные ДНК-полимеразы отличается от описанного в протоколе имеются, использовать создать условия, как описано в соответствующих руководствах. В текущем протоколе, химически компетентную E. палочки клетки используются, что поставляются с комплектом GA. Кроме того, химически или электро компетентный E. штаммы кишечной палочки, такие как DH5 & alpha или DH10B могут быть использованы.
Сборка клонирования 2x основной смеси проста в использовании с минимальными руки-на время. Однако, точной пипетки требуется из-за малых объемов пеEDED быть смешаны вместе. Хорошо метода молекулярной биологии должно быть исполнен в любое время, а также.
GA клонирование предлагает неограниченные возможности для построения фрагментов ДНК, плазмид и векторов, которые больше, чем 3 кб по размеру. Кроме того, он имеет более широкое значение в области синтетической биологии, так как он позволяет синтез и сборку, например, вся бактериальная (Mycoplasma тусоШез) генома или дрожжи (Saccharomyces CEREVISIAE) хромосом 20,21. Способ также применим к обычным клонирование необходимо для генерации бесшовных конструкции.
В заключение, GA клонирование предлагает быстрый, надежный и гибкую альтернативу обычным способом клонирования ДНК.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Михаэла Янсен в Texas Tech University Health Sciences Center, Лаббок, Техас и Младен Йовчев в университете Питтсбурга медицинский центр, Питсбург, штат Пенсильвания для щедро обеспечивая pcDNA 3,1 Мус-His (А) и hEF1α промоутер, содержащие плазмиды , В исследовании, опубликованном в данной публикации, была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития Национальных Институтов Здоровья при премии числа R01HD037109 (в СКК). Дополнительная поддержка была от Laura Буша-младшего Института женского здоровья (в СКК и PNG). Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
| DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification system |
| Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
| DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
| DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
| NheI | New England BioLabs | R3131S | |
| NotI | New England BioLabs | R3189S | |
| HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
| EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
| NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
| NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |
Referências
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
- Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
- Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
- Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
- Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
- Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
- Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
- Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
- Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
- Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
- MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
- Sabath, I., et al. 3′-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
- Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3′-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
- Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
- Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3′ end processing. Nucleic acids research. , (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
- Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
- Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
- Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).
