Summary

Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para<em> In Vitro</em> Os ensaios mielinização

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Abstract

Mielinização é um processo complexo que envolve ambos os neurónios e as células formadoras de mielina da glia, oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC) e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP). Usamos um ensaio in vitro mielinização, um modelo estabelecido para o estudo da mielinização do SNC in vitro. Para fazer isso, as células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) são adicionados aos gânglio da raiz primária roedor dorsal (DRG) neurónios purificados para formar myelinating co-culturas. A fim de interrogar especificamente os papéis que determinadas proteínas expressas pelos oligodendrócitos exercer sobre mielinização nós desenvolvemos protocolos que transduzem seletivamente OPCs usando o lentivírus overexpressing tipo selvagem, proteínas negativas constitutivamente ativos ou dominantes antes de serem semeadas em neurônios do GRD. Isso nos permite interrogar especificamente as funções destas proteínas na regulação oligodendrogliais mielinização. Os protocolos podem também ser aplicado no estudo de otos tipos de células, proporcionando assim uma abordagem que permite a manipulação selectiva de proteínas expressas por um tipo de célula desejado, tais como oligodendrócitos orientada para o estudo de mecanismos de sinalização e de compensação. Em conclusão, a combinação de ensaio in vitro com a mielinização lentivirais infectados OPCs fornece uma ferramenta estratégica para a análise dos mecanismos moleculares envolvidos na mielinização.

Introduction

Mielinização de axónios é crucial para a transmissão rápida e eficiente do potencial de acção em ambos os sistemas nervosos central e periférico. As células especializadas, as células de Schwann no sistema nervoso periférico e oligodendrócitos no sistema nervoso central, enrole e embainham axônios em mielina, efetivamente isolamento do nervo e que facilitam a condução saltatory 1. O processo de mielinização pode ser estudada in vitro usando neurónios ganglionares da retina 2, 3, nanofibras modificadas ou neurónios do gânglio da raiz dorsal de co-cultivados quer com células de Schwann 4 ou oligodendrócitos 5-7. O ensaio de mielinização in vitro é um modelo estabelecido para o estudo da mielinização do sistema nervoso e que replica muitos dos processos fundamentais que ocorrem durante a mielinização in vivo 5-8. O teste envolve a co-cultura das populações puras de gânglio de raiz dorsal (DRG) neurônios, com OPCs (para CNS mielinização) ou células de Schwann (por PNS) mielinização. Sob condições específicas destas células mielinizantes embainham axónios DRG na ordenada, ultra-estruturalmente verificado, folha multi-lamelar de isolamento membrana plasmática que expressam o mesmo complemento de proteínas específicas de mielina presentes in vivo.

O modelo de célula mais vulgarmente utilizado de estudar a mielinização do SNC in vitro é a co-culturas de neurónios DRG e OPCs, que têm sido utilizados com êxito para estudar o efeito de que os factores exógenos, tais como as neurotrofinas exercer sobre a mielinização do SNC in vitro 5,6. Factores exógenos, tais como factores de crescimento ou inibidores farmacológicos de moléculas pequenas têm sido amplamente utilizado para estudar o papel das vias de sinalização na mielinização DRG utilizando o modelo de co-cultura OPC-7,9. No entanto, nas configurações mistos de co-cultura que contêm ambos os neurónios e os oligodendrócitos, manteve-se formalmente possível que ambos os factores de crescimento ou a farmacovigilâninibidores macological poderiam ter exercido efeitos sobre ambos os neurônios e oligodendrócitos (OL) DRG. Esta não oferecem a capacidade de dissecar especificamente os papéis que as proteínas expressas apenas por DRGs ou oligodendroglia exerce sobre mielinização usando este sistema de célula dual. Para confirmar inequivocamente que a via de sinalização em oligodendroglial regula directamente a mielinização, transdução lentiviral de OPCs, antes da semeadura sobre neurónios DRG para o ensaio de mielinização in vitro, provou ser uma maneira elegante para sobre-expressar tanto o tipo selvagem e as proteínas mutantes, assim como knockdown expressão de proteínas expressas constitutivamente por oligodendrócitos. Assim, esta abordagem oferece uma avenida para interrogar especificamente e manipular as vias de sinalização dentro oligodendrócitos para estudar myelination 9,10.

Neste artigo, apresentamos métodos que desenvolvemos para superexpressão de uma proteína de interesse seletivamente em oligodendrócitos através de um lentivírusabordagem para estudar a mielinização in vitro. A técnica começa com a geração de vectores de expressão contendo o gene de interesse, quer seja numa tipo selvagem, forma constitutivamente activa ou negativo dominante, que são então subsequentemente clonado no vector pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Este vector (contendo o gene de interesse), o promotor de CMV dador (pENTR L4-R1-pENTR pDNOR-CMV) e lentivector 2K7 são combinados numa reacção de enzima para produzir um vector de 2K7 contendo promotor de CMV, o gene de interesse, uma local interno de entrada ribossomal e GFP (Figura 1). Este constructo gateway 2K7 clonado combinado com o envelope do vírus, e o pacote PMD2.G vírus pBR8.91 podem ser co-transfectados em células HEK293T para gerar lentivírus que pode subsequentemente ser utilizado para transduzir OPCs. Uma vez infectadas com lentivírus os OPCs expressam um alto nível da proteína de interesse. Estes OPCs podem então ser semeadas em culturas de neurônios DRG eo efeito que a expressãode níveis elevados da proteína desejada exerce sobre a mielinização pode ser interrogada. As co-culturas são avaliadas para a expressão da proteína de mielina por análise Western blot e visualizados para a formação de segmentos axonais mielinizadas por imunocitoquímica.

Protocol

NOTA: Todos os animais utilizados para este estudo eram do sexo misto e criados no Biotério do Departamento de Anatomia e Patologia e do Instituto de Neurociências Florey e Pesquisa em Saúde Mental da Universidade de Melbourne. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelos Comitês de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Melbourne. 1. Clonagem de 2K7 Lentivector Antes da clonagem do gene de interesse no vector lentiviral 2K7, subclonar o gene no vecto…

Representative Results

O marcado com bandeira extracelular quinase 1 (Flag-Erk1) relacionado com o sinal de constructo utilizado para a produção de lentivírus é verificada por digestão com enzimas de restrição das construções usadas, incluindo tanto as construções 2K7 e as construções de empacotamento e acessórias necessárias para produção de vírus (Figura 3) . <st…

Discussion

Mielinização de axónios é um processo crucial para a função óptima de ambos os sistemas nervosos central e periférico de vertebrados. A geração e manutenção de axónios mielinizados é um processo complexo e coordenada envolvendo interacções moleculares entre neuronal, glial (a partir de células de Schwann ou oligodendrócitos) e as proteínas de matriz extracelulares. A importância e aplicabilidade deste protocolo é que ele permite a manipulação de proteínas em um tipo específico de célula dentro …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.

Materials

Item Manufacturer Catalog # Notes
2K7 lentivector  Kind gift from Dr Suter9
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100mg
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 115545205
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) Life Technologies A11005
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) Life Technologies A11012
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518-5G
B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement Stem Cell Technologies  5711
BDNF (Human) Peprotech PT450021000
Biotin (d-Biotin) Sigma Aldrich B4639
Bradford Reagent Sigma Aldrich B6916-500ML  
BSA Sigma Aldrich A4161
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-100G
CNTF Peprotech 450-13020
DAKO fluoresence mounting media DAKO S302380-2
DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine Life Technologies 10313039
DNase Sigma-Aldrich D5025-375KU
DPBS Life Technologies 14190250
DPBS, calcium, magnesium Life Technologies 14040182
EBSS Life Technologies 14155063
EcoRI-HF NEB R3101
Entry vectors for promoter and gene of interest Generate as per protocols 1-2
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C
Forskolin  Sigma Aldrich F6886-50MG
Glucose (D-glucose) Sigma-Aldrich G7528
Glycerol Chem Supply GL010-500M See stock solutions
Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115005003
Goat Anti-Mouse IgM  Jackson ImmunoResearch 115005020
Goat Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch 112005167
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
Igepal Sigma Aldrich I3021-100ML 
Insulin  Sigma Aldrich I6634 
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615
Laminin  Life Technologies 23017015
LB Medium See stock solutions
LB-Agar See stock solutions
L-cysteine Sigma-Aldrich C-7477
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415064
L-Glutamate Sigma-Aldrich G1626
L-Glutamine- 200mM (100X) liquid Life Technologies 25030081
LR Clonase II Plus enzyme Life Technologies 12538-120
MEM, NEAA, no Glutamine Life Technologies 10370088
Mouse α βIII Tubulin  Promega G7121
Mouse αMBP (monoclonal) Millipore MAB381
Na pyruvate  Life Technologies 11360-070
NAC Sigma Aldrich A8199
NcoI-HF NEB R3193S
NEBuffer 4 NEB B7004S
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
NGF (mouse) Alomone Labs N-100
NT-3 Peprotech  450-03
O1 antibody – Mouse anti-O1 Millipore MAB344 Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable
O1 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning
O4 antibody – Mouse anti-O4 Millipore MAB345 Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable
O4 hybridoma cells Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning
 Competent Cells Life Technologies A10460
One Shot Stbl competent cells Life Technologies C7373-03
Papain Suspension Worthington/Cooper LS003126
pBR8.91 Kind gift from Dr Denham10
PDGF-AA (Human) Peprotech PT10013A500  
Penicillin- Streptomycin 100X solution Life Technologies 15140122
pENTRY4IRES2GFP Invitrogen 11818-010 
pMD2.G Addgene 12259
Poly-D-lysine Sigma P6407-5MG
Polyethylenimine (PEI)  Sigma-Aldrich 408727-100ML
Poly-L-ornithine  Sigma Aldrich  P3655
Progesterone  Sigma Aldrich P8783
Protease inhibitor tablet (Complete mini) Roche 11836153001
Proteinase K Supplied with Clonase enzyme
Putrescine Sigma Aldrich P-5780
Rabbit α neurofilament Millipore AB1987  
Rabbit αMBP (polyclonal) Millipore AB980
Ran2 hybridoma cells ATCC TIB-119 Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning
Rat anti CD140A/PDGFRa antibody BD Pharmingen 558774
SacII NEB R0157
SOC medium Supplied with competent bacteria
Sodium selenite  Sigma Aldrich S5261
Spe I NEB R0133S
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Buffer NEB B0202S
TE buffer pH8 See stock solutions
TNE lysis buffer
Trace Elements B Cellgro  99-175-CI
Transferrin (apo-Transferrin human) Sigma-Aldrich T1147
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White Roche 10109878001
Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) Life Technologies 25300-054
Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 Vector laboratories  L-1100
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G

Referências

  1. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
  2. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  3. Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
  4. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  5. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  6. Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
  7. Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).
  8. Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. . Tissue culture methodes for the study of myelination. , (1991).
  9. Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
  10. Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
  11. Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
  12. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  13. Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).

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Citar este artigo
Peckham, H. M., Ferner, A. H., Giuffrida, L., Murray, S. S., Xiao, J. Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays. J. Vis. Exp. (95), e52179, doi:10.3791/52179 (2015).

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