אפיון תאי מיאלואידית מוח לאחר שבץ יכול להתבצע על ידי stereology בשיטת fractionator האופטית, או על ידי ניתוח התזרים cytometric של מוח לויקוציטים השעיות. שניהם טכניקות שימושיות לבצע הבחנה phenotypical מדויקת של תת תא מיאלואידית העיקרי נמצאים במוח איסכמי.
הפעלת מיקרוגליה, כמו גם extravasation של מקרופאגים ונויטרופילים haematogenous, הוא האמין לשחק תפקיד מרכזי בפגיעה מוחית לאחר שבץ. תת-אוכלוסיות תא מיאלואידית אלה יכולים להציג פנוטיפים ופונקציות שונים וצריכים להיות מכובד ומאופיינות ללמוד תקנתם ותרומתם לנזק לרקמות. פרוטוקול זה מספק שתי שיטות שונות לאפיון תאים חיסוני במוח: גישת stereological מדויקת וניתוח התזרים cytometric. גישת stereological מבוססת על השיטה האופטית fractionator, המחשבת את המספר הכולל של תאים באזור של עניין (מוח infarcted) מוערכת על ידי דגימה מקרית שיטתית. גישת האפיון השנייה מספקת דרך פשוטה לבודד השעיות ויקוציטים המוח ולאפיין אותם על ידי cytometry זרימה, המאפשר לאפיון של מיקרוגליה, הסתנן מונוציטים ונויטרופילים של הרקמה איסכמית. בנוסף, הוא גם דetails מודל איסכמיה מוחית בעכברים שבאופן בלעדי משפיע קליפת מוח, יצירת אוטמי שחזור מאוד עם שיעור נמוך של תמותה, ואת ההליך לעיבוד היסטולוגית המוח לאפיין נפח אוטם בשיטת Cavalieri.
שינויים מורפולוגיים, פנוטיפי וביטוי גנים של מיקרוגליה, כמו גם extravasation והפעלה של מקרופאגים ונויטרופילים haematogenous הם האמינו לשחק תפקיד מרכזי במפל pathophysiological בעקבות פציעת מוח 1-4. פרוטוקול זה מספק שתי גישות כדי להעריך את המספר של תת תא מיאלואידית שונה של מוח איסכמי ולבצע אפיון phenotypical. בנוסף, הוא גם מספק תיאור של מודל ניסיוני של איסכמיה המוחית בעכברים, אשר מורכב של קשירה החולפת או קבועה של שני עורק המוח התיכון דיסטלי (MCA) ועורק התרדמה המשותפת (CCA), כולל כיצד להעריך את האוטם בשיטה מדויקת Cavalieri באמצעות תוכנת stereological.
הגישה הראשונה לאפיין תת תא מיאלואידית של מוח איסכמי היא שיטה stereological מבוססת על גישת fractionator האופטית 5. זהו ביותרנפוץ בדיקה stereological בתחום מדעי חיים ומספק רמה גבוהה של דיוק עם מקדמים נמוכים של שגיאת 5-7. זה הוא הבחירה הטובה ביותר לכימות תא כאשר הרקמה היא לחתוך למקטעים, כפי שהוא ימנע את ההטיה בהערכת תא בגלל הפיצול של הרקמה למקטעים. שיטה זו היא דרך חזקה מאוד לאפיין מספרים, דינמיקה ושינויים פנוטיפי של תת-אוכלוסיות נויטרופילים הסתננו של הרקמה איסכמית 8.
גישת האפיון השנייה מבוססת על פרוטוקול שונה מקמפנלה ומשתפי פעולה 9 שמספק דרך פשוטה לבודד השעיות ויקוציטים מוח ולאפיין אותם על ידי cytometry זרימה. בניגוד לשיטות immunohistochemical קונבנציונליים, cytometry זרימת אפיון מאפשר הבחנה בין microglia (CD45 lo CD11b +) והסתננתי תאי מיאלואידית (CD45 היי CD11b +) המבוסס על ההבדל שלהםרמות ביטוי erent של CD45 9-13. בנוסף, מונוציטים פרו-דלקתיים (היי CD11b + Ly-6G CD45 – היי Ly-6C), נויטרופילים (היי CD11b + Ly-6G + CD45) ניתן להבחין ותת leukocytes אחרות של הרקמה איסכמית. גישה זו מספקת assay אמין והמהיר כדי להעריך neuroinflammation במודלים ניסיוניים של איסכמיה. עם זאת, עיבוד רקמות יכול להשפיע על מצב ההפעלה ומספרים של אוכלוסיות תאים השונות הנמצאות ברקמה איסכמית מתן אפיון חצי כמותית.
מודל איסכמיה המוחי הציג כאן נותן כרכי אוטם מאוד לשחזור נקבעו 24-48 שעות ו -7 ימים לאחר MCA קשירה ידי גישות שונות 8,15,17. יש מודל MCAO זה שיעור נמוך תמותה (פחות מ -1%) בהשוואה לאחרים, צמצום מספר בעלי החיים המשמשים במחקרים. שלב קריטי כדי להשיג את השיעור הנמוך הזה של תמותה הוא לשמור על תנאים אספטיים נאותים כדי למנוע זיהומים שעלולים לפגוע בהישרדות לאחר אינדוקציה שבץ. מודל MCAO זה יכול לא רק לשמש כמודל MCAO קבע, שנחשב למודל רלוונטי קליני למחקר translational 18, אלא גם כמודל חולף ידי קשירה זמנית של המרכז לאמנות העכשווית וMCA עם Slipknot וreperfusion האחורי בזמן הרצוי 19. שיטה זו שמשה בהצלחה בעכברים וחולדות 17,20. כל ראיות מצביעות על כך שזה MCAO על ידי קשירה הוא מודל רב-תכליתי גבוה של איסכמיה המוחית עם יישומים מרובים. Critiצעד cal של טכניקה זו הוא שהיא דורשת ניתוח פולשני תחת סטראו; craniotomy צריכה להתבצע בזהירות רבה כדי לא לפגוע בעצם הלחי, כמו גם את MCA. עם זאת, השימוש בבעלי חי דמה (אשר נתון להליך כירורגי אבל קשירת CCA וMCA לא מתבצע) מספק כלי שימושי להפלות השפעות הליך תלוי כירורגית. הבאות בטכניקה זו המידה של פגיעה מוחית ניתן לכמת על ידי מספר שיטות. הפרוטוקול של חתך מוח, מכתים Nissl וההערכה הבאה של אמצעי האחסון על ידי Cavalieri שלנו מאפשר לכימות מדויק של האזור הפגוע וממזער את מספר העכברים המשמשים בסוג זה של מחקרים מאז חלקים במוח הסידורי יכולים לשמש גם לניתוח immunohistochemical שונה. לביצועים טובים יותר של מתודולוגיה זו, זה קריטי לבחור את הפרמטרים המתאימים בשימוש בתוכנת stereology (טבלה 1) שיהיה צורך להערכת הדואר נפח של האזורים השונים על ידי הנוסחא: V = 1 / SSF * * f * t ΣP i (SSF הוא שבר דגימת פרוסה, t הוא העובי הממוצע של הסעיפים, f היא האזור של ריווח הרשת ו ΣP את מספר הנקודות שפגע במבנה).
MCAO דיסטלי על ידי קשירה יכול להיות שימושי כדי לאפיין את ויקוציטים הסתננו ותת-אוכלוסיות של תאים חיסוניים 8,13 המשתתפים בתהליך הדלקתי בעקבות פציעת מוח 1-4. כאן, אנו מציעים שתי שיטות שונות לאפיון תאים חיסוניים במוח, גישת stereological מדויקת וניתוח הזרימה cytometric לטוב האפיון תת-אוכלוסיות leukocytes מרובה.
מנצלת את חתך מוח סדרתי, כימות של המספר הכולל של נויטרופילים יכולה להיות מושגת על ידי השיטה האופטית fractionator 16, האומדת את המספר הכולל של תאים ממספר התאים שנדגמו שנינותחה סט שיטתי נדגמים מקריים (SRS) של חללים משוחדות וירטואליים ספירה מכסים את האזור כולו של עניין, במקרה שלנו באזור האוטם, עם מרחק אחיד בין חללי ספירה וירטואליים משוחדות בX כיוונים, Y ו- Z. שיטה זו מספק כלי מדויק ל להעריך מספרי נויטרופילים הכולל במוח איסכמי בזמנים שונים לאחר קשירה. למרות שזה לא הוכח במחקר זה, פרוטוקול זה יכול לשמש גם להערכה של תת-האוכלוסיות השונות נויטרופילים לאחר איסכמיה 21 ולכימות מדויק של כל אוכלוסיית תאים אחרת הנמצאת במוח איסכמי כמו כדוריות דם לבנות הסתננו אחרים (מונוציטים / מקרופאגים) וגם להערכת הנוירונים ששרדו או אפילו לכימות neurogenesis לאחר שבץ. הצעד החשוב ביותר להערכה מדויקת באזור הרצוי הוא הבחירה של הפרמטרים המתאימים, כמו אלה שמוצגים בטבלה 3 לכימות נויטרופילים באזור איסכמי.פרמטרים אלה ישמשו לתוכנת stereology כדי לחשב את מספר התאים החיוביים הכולל (N) על ידי שימוש במשוואה N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- הוא המספר הכולל של תאים נספרו ב fractionator, SSF הוא שבר דגימת הסעיף, ASF הוא אזור שבר הדגימה, וTSF הוא עובי בר דגימה) 5. למרות שמתודולוגיה זו היא איטית יותר מאשר טכניקות כימות אחרות (לדוגמא, ניתוח של סמני נויטרופילים ידי מ"ג של רקמה, צפיפות של תמונות או מספר הנויטרופילים לכל שדה נציג), יש לו את היתרון להיות משוחד וטכניקה מוצקה המספקת מדויק כימות של מספרים סלולריים.
גישת בידוד ויקוציטים המוח מאפשרת זיהוי בו זמני וכימות של כמה תת תא חיסון ללא הצורך בהטית המערכת על ידי צביעת in vivo או מניפולציות גנטיות. תא לאחר מיון מp מיאלואידית המאופייןopulations או הפרדת immunomagnetic יכול לשמש ליישומים במורד הזרם מרובים, כגון מחקרים נוספים על גן או ביטוי חלבון. האפיון מדויק של נויטרופילים, מונוציטים ומיקרוגליה מתקבלים בשיטה זו מספק סגוליות גבוהה ביחס לשיטות קיימות, כגון מחקרי immunohistochemical, יתרון המאפשר הקצאת פונקציות ספציפיות לתאי מיאלואידית השונים אשר מתווכים תגובה חיסונית מולדת במוח. בנוסף, ניתן להאריך עוד יותר לאפיין אוכלוסיות אחרות במוח עם התווית המתאימה, כמו מקרופאגים דם נולד (CD11b + היי CD45 CD68 +), וזה יכול להיות מיושם לחקר פתולוגיות אחרות במערכת העצבים המרכזית או פציעות. לכן טכניקה זו מספקת כלי חיוני כדי לחקור את ההטרוגניות של התגובה הדלקתית במוח. מגבלה העיקרית של טכניקה זו מתגוררת בהכנת השעיות ויקוציטים מרקמת המוח טרי, אשר יכולה לשנות אתמצב הפעלה של התאים או שינוי אנטיגן. למרות שטכניקה זו מאפשרת אפיון איכותי יותר מפורט בהשוואה למחקרי immunohistochemical, היא מספקת כימות פחות מדויק המבוסס על בידוד תא. למרות זאת, את היעילות של פרוטוקול בידוד תא שלנו היא דומה לשיטות אחרות שפורסמו 9 וניתן להשתמש בו ביעילות כדי לזהות הבדלים במספר התאים חיסוניים במוח בין שליטה וקבוצות MCAO או אפילו בין קבוצות MCAO נתון לטיפולים שונים 8.
שלבים קריטיים של פרוטוקול זה הם לנתיחה הרקמה, הליך שיבוש רקמות, והסרת המיאלין. בנוגע לאיסוף הרקמות, ניתן לכלול צעד נורמליזציה (בהתחשב ברקמה שנאספו), כדי למנוע השתנות בשל הופעות נתיחה שונות. בנוסף, נורמליזציה בין קבוצות MCAO השונות יכולה להתרחש גם דרך נפח אוטם (שנקבע בעבר על ידי R המגנטיesonance). דרך נוספת לפתור את הבעיה הזו היא להשתמש בכל חצי הכדור ipsilateral של שני קבוצות איסכמי ושליטה, או אפילו להשתמש באונה הנגדית של עכבר איסכמי כביקורת כדי למזער את מספר בעלי החיים המשמשים. בעוד גישה זו נמנעת הבדלים בין כל נתיחה, יש לו חסרון עיקרי; גורם לדילול נוסף על ידי הגדלת המספר הכולל של תאים אך לא את מספר תאי מיאלואידית אשר ממוקמים באופן בלעדי בתחומי הליבה ופרי אוטם של קליפת המוח ipsilateral. לגבי שיבוש רקמות, פרוטוקול זה מדגים את השלבים להפרעה המכנית של תאי מוח, הימנעות טיפולים האנזימטית ומניעת שינוי פני השטח אנטיגן 9,22, נושא חיוני לניתוח איכותי וכמותית נוסף של תת-האוכלוסיות של תאים דלקתיים. בנוסף להכנת ההשעיה התא של עניין, הסרת המיאלין מדגימות המוח הוא צעד מומלץ מאוד להימנע מהפרעה לdownstיישומים לקדד, כגון הפרדת תאי immunomagnetic או cytometry זרימת 23,24. זה יכול להיות מושלם תוך שימוש בשיטות שונות, כגון סוכרוז או הדרגתיים Percoll, או חרוזים נגד המיאלין. כאן, ועל סמך מחקרים קודמים שהשוו שיטות שונות לבידוד השעיה תא המוח, הפרעה מכאנית בשילוב עם שימוש Percoll להסיר המיאלין משמש לשיפור תשואות תא ואת כדאיות 25.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |