Cervello cellule mieloidi caratterizzazione seguente ictus può essere eseguita utilizzando il metodo stereologia frazionatore ottica, o da una analisi citofluorimetrica del cervello leucociti sospensioni. Entrambi sono tecniche utili per effettuare un'accurata distinzione fenotipica delle principali sottopopolazioni di cellule mieloidi trovati nel cervello ischemico.
Attivazione della microglia, così come stravaso di macrofagi e neutrofili ematogene, si ritiene di svolgere un ruolo fondamentale in lesioni cerebrali dopo l'ictus. Queste sottopopolazioni di cellule mieloidi possono visualizzare diversi fenotipi e funzioni e devono essere distinti e caratterizzati per studiare la loro regolazione e il contributo al danno tissutale. Questo protocollo prevede due diverse metodologie per la caratterizzazione delle cellule immunitarie del cervello: un approccio stereologica preciso e citometria a flusso. L'approccio stereologica si basa sul metodo frazionatore ottica, che calcola il numero totale di cellule in una zona di interesse (cervello infartuata) stimato per il campionamento casuale sistematico. Il secondo approccio caratterizzazione fornisce un modo semplice per isolare sospensioni leucociti cervello e caratterizzare loro mediante citometria di flusso, consentendo la caratterizzazione della microglia, infiltrato monociti e neutrofili del tessuto ischemico. Inoltre, anche details un modello ischemia cerebrale nei topi che colpisce esclusivamente la corteccia cerebrale, generando infarti altamente riproducibili con un basso tasso di mortalità, e la procedura per l'elaborazione del cervello istologica di caratterizzare il volume dell'infarto dal metodo Cavalieri.
Morfologiche, fenotipiche e alterazioni di espressione genica di microglia, così come stravaso e attivazione dei macrofagi e neutrofili ematogene si ritiene di svolgere un ruolo chiave nella cascata fisiopatologico seguente lesione cerebrale 1-4. Questo protocollo prevede due approcci per stimare il numero di diversi sottoinsiemi di cellule mieloidi del cervello ischemico e per svolgere la loro caratterizzazione fenotipica. Inoltre, fornisce anche una descrizione di un modello sperimentale di ischemia cerebrale in topi, che consiste nella legatura transitoria o permanente di entrambi distale dell'arteria cerebrale media (MCA) e l'arteria carotide comune (CCA), compreso il modo di valutare l'infarto con il metodo Cavalieri accurata utilizzando un software stereologica.
Il primo approccio per caratterizzare sottogruppi di cellule mieloidi del cervello ischemico è un metodo stereologica basato sull'approccio frazionatore ottica 5. Questo è il piùcomunemente usato sonda stereologica in scienze biologiche e fornisce un elevato grado di precisione con bassi coefficienti di errore 5-7. Questa è la scelta migliore per la quantificazione delle cellule quando il tessuto viene tagliato in sezioni, in quanto evita la polarizzazione sulla stima delle cellule a causa della frammentazione del tessuto in sezioni. Questo metodo è un modo molto potente per caratterizzare i numeri, dinamiche e cambiamenti fenotipici di sottopopolazioni neutrofili infiltrati del tessuto ischemico 8.
Il secondo approccio caratterizzazione è basato su protocollo modificato da Campanella e collaboratori 9 che fornisce un modo semplice per isolare cerebrali sospensioni leucociti e caratterizzarli mediante citometria di flusso. In contrasto con tecniche di immunoistochimica convenzionali, citometria a flusso caratterizzazione permette di differenziare tra microglia (CD45 lo CD11b +) e infiltrati cellule mieloidi (CD45 hi CD11b +) in base alla loro difflivelli di espressione di CD45 erente 9-13. Inoltre, monociti pro-infiammatorie (CD45 hi CD11b + Ly-6G – Ly-6C hi), neutrofili (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) e altri leucociti sottoinsiemi del tessuto ischemico possono distinguere. Questo approccio fornisce un test affidabile e rapido per valutare neuroinflammation in modelli sperimentali di ischemia cerebrale. Tuttavia, il trattamento del tessuto può influenzare lo stato di attivazione e numero delle diverse popolazioni cellulari presenti nel tessuto ischemico fornire una caratterizzazione semi-quantitativa.
Il modello di ischemia cerebrale introdotto qui dà volumi infarto altamente riproducibili determinati 24-48 ore e 7 giorni dopo MCA legatura da approcci diversi 8,15,17. Questo modello MCAO ha un basso tasso di mortalità (meno dell'1%) rispetto agli altri, riducendo al minimo il numero di animali usati in studi. Un passo fondamentale per ottenere questo basso tasso di mortalità è di mantenere condizioni asettiche adeguate per evitare le infezioni che potrebbero compromettere la sopravvivenza dopo l'induzione ictus. Questo modello MCAO non può essere utilizzato solo come modello MCAO permanente, che è considerato un modello clinico rilevante per la ricerca traslazionale 18, ma anche come un modello transitorio mediante legatura transitoria del CCA e MCA con un cappio e posteriore riperfusione al momento desiderato 19. Questo metodo è stato utilizzato con successo in topi e ratti 17,20. Tutte queste prove indicano che MCAO mediante legatura è un'alta versatile modello di ischemia cerebrale con più applicazioni. A Critical passo di questa tecnica è che richiede un intervento chirurgico invasivo allo stereomicroscopio; craniotomia deve essere eseguita con molta attenzione per non danneggiare la zigomo nonché la MCA. Tuttavia, l'uso di animali sham (che sono sottoposte alla procedura chirurgica ma CCA e MCA legatura non viene eseguita) fornisce uno strumento utile per discriminare effetti dipendenti dalla procedura chirurgica. L'entità del danno cerebrale dopo questa tecnica può essere quantificata mediante diversi metodi. Il nostro protocollo di sezionamento cerebrale, Nissl e successiva stima del volume Cavalieri permette una quantificazione accurata della regione danneggiata e minimizza il numero di topi utilizzati in questo tipo di studi dal sezioni di cervello seriale possono essere utilizzati anche per l'analisi immunoistochimica differente. Per una migliore prestazione di questa metodologia, è fondamentale scegliere i parametri appropriati utilizzati nel software stereologia (Tabella 1), che saranno necessari per la stima the volume delle diverse regioni dalla formula: V = 1 / * SSF un f * t * ΣP i (SSF è la frazione di campionamento fetta, t è lo spessore medio delle sezioni, una f è l'area della spaziatura della griglia e ΣP il numero di punti di colpire la struttura).
Il distale MCAO da legatura può essere utile per caratterizzare la leucociti infiltrati e sottopopolazioni di cellule immunitarie 8,13 che partecipano al processo infiammatorio dopo un trauma cerebrale 1-4. Qui, proponiamo due diverse metodologie per la caratterizzazione delle cellule immunitarie del cervello, un approccio stereologica precisa e una citometria a flusso per una migliore caratterizzazione più leucociti sottopopolazioni.
Sfruttando sezionamento cerebrale seriale, la quantificazione del numero totale di neutrofili può essere ottenuto mediante il metodo frazionatore ottica 16, che stima il numero totale di cellule dal numero di celle di spirito campionataha sistematica Casualmente campionati (SRS) insieme di spazi imparziali conteggio virtuali che coprono l'intera regione di interesse, nel nostro caso la regione infartuale, con distanza uniforme tra imparziali spazi conteggio virtuali in direzioni X, Y e Z. Questo metodo fornisce uno strumento preciso per stimare il numero totale dei neutrofili nel cervello ischemico in tempi diversi dopo la legatura. Anche se non è stato dimostrato in questo studio, questo protocollo può essere utilizzato anche per la stima delle differenti sottopopolazioni neutrofili dopo ischemia 21 e per una quantificazione accurata di qualsiasi altra popolazione cellulare trovato nel cervello ischemico come altri leucociti infiltrati (monociti / macrofagi) ed anche per la stima neuroni sopravvissuti o anche per neurogenesi quantificazione dopo l'ictus. Il passo più importante per una stima accurata nella zona desiderata è la selezione dei parametri appropriati, come quelli indicati nella Tabella 3 per neutrofili quantificazione nella zona ischemica.Questi parametri saranno utilizzati per il software stereology per calcolare il numero totale di cellule positive (N) utilizzando l'equazione N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / ASF x 1 / TSF (ΣQ- è il numero totale di cellule contate con frazionatore, SSF è la frazione di campionamento sezione ASF è l'area frazione di campionamento, e TSF è lo spessore frazione di campionamento) 5. Anche se questo metodo è più lento rispetto ad altre tecniche di quantificazione (per esempio, l'analisi di marcatori neutrofili per mg di tessuto, densitometria di immagini rappresentative o numero di neutrofili per campo), ha il vantaggio di essere un imparziale ed una tecnica solida che fornisce una precisa quantificazione del numero di cellule.
L'approccio di isolamento leucociti cervello permette una contemporanea identificazione e la quantificazione dei diversi sottotipi di cellule immunitarie senza la necessità di polarizzare il sistema di colorazione in vivo o manipolazioni genetiche. Cell successivo smistamento della p mieloide caratterizzatoopulations o la loro separazione immunomagnetica possono essere utilizzati per molteplici applicazioni a valle, quali ulteriori studi sul gene o espressione della proteina. La caratterizzazione accurata dei neutrofili, monociti e microglia ottenute con questo metodo offre elevata specificità rispetto a metodi esistenti, come gli studi di immunoistochimica, un vantaggio che permette di assegnare funzioni specifiche per le diverse cellule mieloidi che mediano cervello risposta immunitaria innata. Inoltre, può essere ulteriormente esteso per caratterizzare altre popolazioni del cervello con l'etichetta, come via sanguigna macrofagi (CD11b + CD45 + CD68 hi), e può essere applicata per lo studio di altre patologie del sistema nervoso centrale o lesioni. Pertanto questa tecnica fornisce uno strumento essenziale per esplorare l'eterogeneità della risposta infiammatoria nel cervello. Un limite principale di questa tecnica risiede sulla preparazione delle sospensioni leucociti da tessuto cerebrale fresco, che possono alterare lastato di attivazione delle cellule o loro alterazione antigene. Sebbene questa tecnica consente una caratterizzazione qualitativa più dettagliata rispetto agli studi immunoistochimici, fornisce una quantificazione meno accurato basato su isolamento delle cellule. Nonostante ciò, l'efficienza del nostro protocollo di isolamento cellulare è simile ad altre metodologie pubblicato 9 e può essere utilizzato in modo efficiente per rilevare differenze nel numero di cellule immunitarie cerebrali tra controllo e gruppi MCAO o anche tra gruppi MCAO sottoposti a diversi trattamenti 8.
Passaggi critici di questo protocollo sono la dissezione dei tessuti, la procedura di interruzione dei tessuti, e la rimozione mielina. Per quanto riguarda la raccolta dei tessuti, un passo normalizzazione può essere incluso (pesando il tessuto raccolto) per evitare la variabilità a causa di diversi spettacoli di dissezione. Inoltre, la normalizzazione tra diversi gruppi MCAO può anche avvenire attraverso volume dell'infarto (precedentemente determinato Magnetic Resonance). Un altro modo per risolvere questo problema è quello di utilizzare tutto l'emisfero ipsilaterale di entrambi i gruppi ischemici e di controllo, o anche utilizzare l'emisfero controlaterale del mouse ischemico come controllo per minimizzare il numero di animali utilizzati. Mentre questo approccio evita differenze tra ogni dissezione, ha uno svantaggio principale; un fattore di diluizione viene aggiunto aumentando il numero totale di cellule, ma non il numero di cellule mieloidi che si trovano esclusivamente nelle aree centrali e peri-infarto della corteccia ipsilaterale. Per quanto riguarda la rottura del tessuto, questo protocollo illustra i passi per la distruzione meccanica delle cellule cerebrali, evitando trattamenti enzimatici e prevenire la superficie antigene di alterazione 9,22, una questione fondamentale per l'ulteriore analisi qualitativa e quantitativa delle sottopopolazioni di cellule infiammatorie. Oltre alla preparazione della sospensione cellulare di interesse, la rimozione mielina da campioni cerebrali è un passo altamente raccomandato per evitare interferenze con oa valleapplicazioni risma, come ad esempio la separazione immunomagnetica o citometria a flusso 23,24. Questo può essere realizzato con metodi diversi, come saccarosio o gradienti di Percoll, o perline anti-mielina. Qui, e in base a precedenti studi che mettono a confronto diversi metodi per l'isolamento delle cellule cerebrali sospensione, interruzione meccanica in combinazione con l'utilizzo Percoll per rimuovere mielina viene utilizzato per migliorare le rese e la vitalità cellulare 25.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |