다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다.
미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라 haematogenous 식세포와 호중구의 혈관 외 유출은 뇌졸중 후 뇌 손상에서 중추적 역할을하는 것으로 생각된다. 이 골수 세포 개체군은 서로 다른 표현형 및 기능을 표시하고 구별 할 필요가 있고 조직 손상에 대한 그들의 규제와 공헌을 연구하는 특징으로 할 수 있습니다. 정확한 stereological 방법 및 유세포 분석 :이 프로토콜은 뇌 면역 세포의 특성화를 위해 두 가지 방법을 제공합니다. stereological 체계적인 접근법은 랜덤 샘플링에 의해 추정이자 (뇌 경색)의 영역에서 세포의 총 수를 계산 광학 분별 법에 기초한다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 현탁액 백혈구를 분리 및 미세 아교 세포의 특성 분석을 허용 유세포들을 특성화하는 간단한 방법을 제공하고, 단핵구 및 호중구 허혈성 조직의 침투. 또한, 교리독점적 사망률의 낮은 속도 및 카발리 법으로 경색 량을 특성화 뇌 조직 학적 처리 절차 재현성 경색을 발생, 뇌 피질에 영향을 쥐 뇌허혈 모델 etails.
형태 학적 표현형 및 미세 아교 세포 유전자 발현의 변화뿐만 아니라, 혈관 외 유출 및 haematogenous 식세포의 활성화 및 호중구가 뇌 손상 1-4 다음 병리 생리 캐스케이드에서 핵심적인 역할을 수행 할 것으로 생각된다. 이 프로토콜은 두 가지 방식 허혈성 뇌 골수 세포의 다른 서브 세트들의 수를 추정하고 자신의 표현형을 특성화를 수행하기 위해 제공한다. 또한, 또한, 방법 경색을 평가 포함 원위부 중뇌 동맥 일시적 또는 영구적 결찰 (MCA) 및 총 경동맥 (CCA)로 구성되어 마우스에서 대뇌 허혈 실험 모델의 설명을 제공한다 stereological 소프트웨어를 사용하여 정확한 카발리 법에 의해.
허혈성 뇌의 골수 세포의 서브 세트를 결정하기에 첫 번째 방법은 광학 분별 접근법에 기초하여 5 stereological 방법이다. 이것은 대부분이며일반적으로 생명 과학 분야 stereological 프로브를 사용하고 오류 5-7의 낮은 계수와 높은 정확도를 제공한다. 이 때문에 섹션으로 조직의 분열의 세포 추정에 대한 편견을 피할 수로 조직이, 섹션으로 잘라 때이 세포 정량을위한 최고의 선택입니다. 이 방법은 숫자, 역학과 허혈성 조직 (8)의 침투 호중구 개체군의 표현형 변화를 특징 짓는 매우 강력한 방법입니다.
두 번째 접근법은 특성화 뇌 백혈구 현탁액을 분리 및 유동 세포 계측법에 의해이를 특성화하는 간단한 방법을 제공 캄파넬라 협력자 (9)로부터 개질 된 프로토콜에 기초한다. 종래의 면역 조직 화학 기법과 대조적으로, DIFF에 기초하여 자신의 골수 세포 (CD45 하이는 CD11b +)을 특성화 (LO는 CD11b + CD45) 미세 아교 세포를 구별 허용 유동 세포 계측법 및 침투CD45 9-13의 erent 발현 수준. 또한, 염증성 단구 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G – LY-6C 안녕은), 호중구는 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G +) 및 허혈성 조직의 다른 백혈구 부분 집합 구별 할 수있다. 이 접근법은 뇌 허혈 실험 모델에서 신경 염증을 평가하는 신뢰성 있고 신속한 분석을 제공한다. 그러나, 조직 처리가 활성화 상태와 반 정량적 특성을 제공 허혈성 조직에서 발견되는 다양한 세포 집단의 수에 영향을 미칠 수있다.
여기에서 소개 뇌허혈 모델은 높은 재현성 경색 볼륨이 24 ~ 48 시간과 다른 접근 방법 8,15,17으로 MCA 결찰 후 7 일 결정 제공합니다. 이 MCAO 모델 연구에 사용 된 동물의 수를 최소화하는 다른 사람에 비해 낮은 사망률 (1 % 미만)을 갖는다. 사망률이 낮은 비율을 얻기 위해 중요한 단계 뇌졸중 유도 후 생존에 손상을 줄 수있는 감염을 방지하기 위해 적절한 무균 상태를 유지하는 것이다. 이 MCAO 모델은 또한 원하는 시간 매듭 후방 재관류 CCA 및 MCA 과도 결찰술 일시적인 모델로서, 병진 연구 18 임상 관련 모델 간주 영구 MCAO 모델로서 이용 될 수 없다 19. 이 방법은 성공적으로 마우스 및 래트 17,20 사용되어왔다. 이 모든 증거는 결찰에 의해 MCAO 여러 응용 프로그램과 뇌경색의 높은 다양한 모델을 나타냅니다. criti이 기술의 CAL 단계는 실체 현미경 침습 수술을 필요로한다는 것이다; MCA뿐만 아니라 광대뼈 손상되지로서 개두술은 매우 신중하게 수행되어야한다. 그러나 가짜 동물의 사용 수술에 의존하는 효과를 구별 할 수있는 유용한 도구가 제공 (수술하지만 CCA와 MCA 결찰을 실시한다 수행되지 않습니다). 이 기술에 따라 뇌 손상의 정도는 다양한 방법에 의해 정량화 될 수있다. 뇌 절편, Nissl 염색 및 카발리 의한 체적의 후속 추정 우리 프로토콜은 손상된 영역의 정확한 정량 분석이 가능하며 직렬 뇌 섹션이 또한 서로 다른 면역 분석에 이용 될 수 있기 때문에, 연구의 이러한 유형에서 사용 된 마우스의 수를 최소화한다. 이 방법론의보다 나은 성능이 Stereology를 소프트웨어에 사용 된 적절한 파라미터를 선택하는 것이 중요하다 (표 1) 번째를 추정 할 필요식 상이한 영역의 전자 량 : V = 1 / SSF는 * f를 * t의 *의 ΣP 난 (SSF는 t가 섹션의 평균 두께, 슬라이스 샘플링 분획이고, f는 그리드 간격의 면적이며 ΣP 구조 타격 포인트의 수).
결찰술 원위 MCAO은 백혈구 침윤 및 면역 세포 아 집단 뇌 손상 1-4 다음 염증 과정에 참여하는 8, 13를 특성화하는 것이 유용 할 수있다. 여기서는 뇌 면역 세포 특성화, 정확한 접근법 stereological 나은 여러 백혈구의 아 집단을 특성화 유세포 분석을위한 두 가지 방법을 제안한다.
직렬 뇌 절편을 살려, 호중구의 총수의 정량화 세포 샘플 재치 수의 세포의 총 수를 추정 광학 분별 법 (16)에 의해 달성 될 수있다하 방향 X에 편견 가상 계산 공간 사이의 균일 한 거리와 우리의 경우, 경색 영역을 관심의 전체 영역을 커버 편견 가상 계산 공간의 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 세트, Y 및 Z를이 방법에 대한 정확한 도구를 제공합니다 결찰 후 서로 다른 시간에 허혈성 뇌에 총 호중구 수를 추정한다. 이 본 연구에 도시되지 않았지만,이 프로토콜은 또한 허혈 21 후에 다른 침윤 백혈구 등의 허혈성 뇌에서 발견 된 임의의 다른 세포 집단의 정확한 정량 다른 호중구 개체군의 추정을 위해 사용될 수있다 (단핵구 / 대 식세포) 또한 생존 신경을 추정 또는 뇌졸중 후 신경의 정량. 것들 허혈 영역에서 호중구 부량 표 3에 나타낸 바와 같이, 원하는 영역의 정확한 추정을위한 가장 중요한 단계는, 해당 변수의 선택이다.이러한 매개 변수는 (ΣQ- 함께 카운트 세포의 총 수이고 N = ΣQ- X 1 / SSF X 1 / ASF X 1 / TSF를 수학 식을 이용하여 전체 포지티브 세포 수 (N)를 계산하는 Stereology를 소프트웨어에 사용될 분별, SSF는 ASF 샘플링 면적 분율이고, TSF는 샘플링 분획 두께) (5)이고, 부 샘플링 비율이다. 이 방법론은 다른 정량화 기법보다 느리지 만 (예를 들어, 조직, 대표적인 이미지 또는 필드 당 호중구 수의 밀도 측정의 MG 의한 호중구 마커의 분석), 그것은 공평하고 정확한 제공 고체 기법이 될 수있는 장점을 갖는다 세포 수의 정량.
뇌 백혈구 분리 방식은 바이어스 할 필요 생체 염색 또는 유전자 조작에 의해 시스템이없는 동시 식별 및 여러 면역 세포 아형의 정량화 수 있습니다. 특징 골수 페이지에서 정렬 이후 세포opulations 또는 면역 자기 분리가 이러한 유전자 또는 단백질 발현에 대한 추가 연구 하류 여러 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 방법으로 얻은 호중구, 단핵구 및 미세 아교 세포의 정확한 특성은 면역 조직 화학적 연구, 뇌의 선천성 면역 반응을 매개하는 다른 골수 세포에 특정 기능을 할당 할 수있는 장점으로 기존의 방법에 대해 높은 특이성을 제공합니다. 또한, 추가로 혈액 태어난 식세포 (는 CD11b + CD45 하이 CD68 +)와 같이, 적절한 라벨 다른 뇌 개체군을 특성화하도록 확장 될 수 있으며 다른 CNS 병리 또는 부상의 연구에 적용 할 수있다. 따라서이 기술은 뇌의 염증 반응의 이질성을 탐구하는 필수적인 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 제한을 변경할 수있는 새로운 뇌 조직으로부터 백혈구 현탁액의 제조에 상주세포 또는 항원 변경의 활성화 상태. 이 기술은 면역 조직 화학 연구에 비해보다 상세한 정 성적 특성 분석을 할 수 있지만, 그것은 세포의 분리에 기초하여 덜 정확한 정량화를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 우리 세포 격리 프로토콜의 효율은 다른 출판 방법론 9 유사하고이를 효율적으로 제어하고 MCAO 그룹 사이 또는 심지어 다른 처리 8 실시 MCAO 그룹 사이의 뇌 면역 세포의 수의 차이를 검출하는데 사용될 수있다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 해부 조직, 조직 파괴 절차 및 미엘린 제거한다. 조직 수집에 대해서, 정규화 단계 인해 상이한 박리 성능에 변동을 피하기 위해 (수집 된 조직을 칭량) '도 포함될 수있다. 또한, 다른 그룹 사이 MCAO 정규화는 경색 량 통해 발생할 수 (미리 자기 R에 의해 결정esonance). 이 문제를 해결하는 또 다른 방법은 허혈성과 대조군의 전체 동측 반구를 사용하거나, 심지어 사용 된 동물의 수를 최소화하는 대조군으로서 마우스의 허혈성 반구 반대측을 사용하는 것이다. 이 방법은 각 절개 차이점을 회피 동안, 주요 단점이있다; 희석 배수는 독점적 동측 피질의 코어 및 경색 주변 영역에있는 골수 세포의 수를 셀의 총 개수를 증가 아니지만 의해 부가된다. 조직 파괴에 대해서는,이 프로토콜은 뇌 세포의 기계적 파쇄 단계 효소 처리를 방지하고 표면 항원 변조 9,22, 염증 세포 개체군의 추가적인 정성 및 정량 분석을위한 필수적인 문제를 방지를 나타낸다. 관심의 세포 현탁액의 제조뿐만 아니라, 뇌 샘플로부터 미엘린 제거 downst와의 간섭을 피하기 위해 추천 단계는이러한 면역 자기 세포 분리 또는 세포 계측법 (23, 24) 흐름으로 연 응용 프로그램. 이것은 여러 가지 방법, 예컨대 수크로오스 또는 퍼콜 구배, 또는 항 미엘린 비드를 사용하여 달성 될 수있다. 여기, 세포 수율을 개선하는 데 사용됩니다 수초를 제거하는 퍼콜 사용과 함께 뇌 세포 현탁액 분리, 기계적 중단을위한 다른 방법을 비교하고 25 생존 이전의 연구를 기반으로.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |