Высокое содержание изображений Пробирной для идентификации ботулинического нейротоксина ингибиторов

Бактерия Clostridium ботулинического производит нейротоксин ботулизма, один из самых мощных биологических токсинов, известных человеку ^1. Есть 7 различных ботулинического токсина серотипа (ботулинического токсина / AG). BoNT / A-Галль вызвать паралич в нервно-мышечном соединении из-за SNARE комплекса протеолиза ^2,3. SNARE протеолиз предотвращает нейромедиатора везикул-слияние мембран и, следовательно, блоки нейротрансмиттеров экзоцитоз ^4. Конкретный целевой SNARE, зависит от конкретного BoNT серотипа, вовлеченной в процесс интоксикации. BoNT / и BoNT / E расщепляют SNAP-25, тогда как BoNT / C расщепляет обе SNAP-25 и синтаксина ^5. Остальные серотипов расщепляют синаптобревин (также называется везикул, ассоциированных мембранный белок (VAMP). BoNT / была выбрана для разработки анализа, как он отвечает за высокой долей природного ботулизма и имеет самую длинную продолжительность действия ^6. Развитие малого молекулы терапевтические против BoNT / A является одной из основных целей длянаша программа открытие и использовал традиционные методы целевые основе выявить активные ингибиторы сайт протеолитические ^{7, 8-10.} Тем не менее, создание активных ингибиторов сайта с действием широкого спектра против нескольких серотипов и эффективности постэкспозиционного, вероятно, будет сложным.

Поэтому мы внедрили инновационную фенотипическую наркотиков подход обнаружения, которая использует BoNT SNAP-25 расщепление в качестве функциональной конечной точки для определения малых молекул, которые могут блокировать BoNT-опосредованной двигательных нейронов интоксикации. SNAP-25 необходим для высвобождения нейротрансмиттеров, как деградация SNAP-25 является предиктором паралича и летальности в естественных условиях. Например, на основе клеток скрининг может привести к обнаружению новых модуляторов клеточных факторов, ответственных за токсин инактивации или ингибирования токсина путей внутри клеток-мишеней. Важным фактором в развитии фенотипической анализа является выбор физиологически соответствующих биологических моделей. Wе и другие описали мышиных эмбриональных стволовых (ES) клеток, полученных моторные нейроны, которые воспроизводят иммунологическую характер первичных двигательных нейронов, в том числе выражения SNAP-25 ^{11- 13.} Важно, что эти сотовые системы весьма чувствительны к BoNT / A интоксикации и демонстрируют зависимое от дозы расщепление SNAP-25 в ответ на увеличение концентрации токсина ^11,12. Дифференцированные моторные нейроны производятся также в количествах, достаточных для анализа, основанного высокая пропускная пластины и разрешенных дизайн массив клеточных анализов.

Фенотипический анализ является методом иммунофлюоресценции с использованием двух различных антител для количественного расщепление эндогенно выразил полноразмерной SNAP-25 во время BoNT / A интоксикации мыши двигательных нейронов культуры. Карбоксильную терминал BoNT / расщепление чувствительных (BACS) антитело, которое распознает только полную длину SNAP-25 позволяет оценить BoNT / A опосредованного протеолиза SNAP-25выражение в двигателе мыши нейронов ^10. Принципиальная схема анализа HCI изображен на рисунке 1.

Пластинчатые 20000 дифференцированы ЭС клеток мыши (MES) / лунку в 96-луночные Поли-D лизина покрытием пластин и поддерживать в двигательных нейронов терминал среде для дифференцировки в течение 5-7 дней.

1. Соединение Администрация и Интоксикация с BoNT / A

Выполните все следующие работы в BSL2 корпусе, обеспечивать соблюдение принципов CDC / NIH.

1. Подготовка 10 мМ исходные растворы каждого библиотечного соединения в 100% ДМСО в полипропиленовые 96-луночных планшетах. Используйте 10 мМ маточного подготовить промежуточную пластину разбавления, которое в 10 раз больше, чем в желаемой концентрации скрининга. Подготовьте 100 мкМ промежуточную пластину с помощью дозирования 10 мМ маточного в 96-луночный планшет и разбавить его до 100 мкМ использованием питательных сред. Разлить по 10 мкл соединений на 90 мкл среды на клетки ^11. Проверьте соединения на 10 мкм конечной концентрации и обеспечить окончательное процент ДМСО не превышает 0,5%.
2. Выполните все шпильких годов, которые используют живые клетки и активный токсин под уровнем биобезопасности 2 условия. Заменить старые носители в 96-луночных планшетах с с 80 мкл свежей среде для дифференцировки терминал с помощью ручного пипетки 12 канала. Провести стремление и обойтись шаги по строкам, чтобы избежать воздействия клеток без СМИ в окружающий воздух.
3. Предварительной обработки клеток с соединениями до применения токсина путем добавления 10 мкл 10х соединений из исходного пластины с помощью пипетки 12 канала, а затем перемешивали с помощью аспирации (два раза). Для каждого 96-луночного планшета, лечить две колонки 6 скважин с 10-кратным ДМСО, разведенного в средствах массовой информации, чтобы служить в качестве сигнала высокой и низкой контроля сигналов. Колонна без лечения ботулинического токсина наблюдается самый высокий уровень по всей длине SNAP-25 (высокая управления сигнал). Лечить другой столбец с BoNT одиночку (без каких-либо соединений) в качестве контроля низкого сигнала. Используйте низкий контроль наблюдать эффективность ботулинического токсина расщепления SNAP-25 и его обнаружения с антителом BACS (рисунок 2).
4. Инкубируйте клетки с соединениями течение 30 мин при 37 ° С и _6% CO2 в инкубаторе для клеточных культур.
5. Подготовьте A ботулинического нейротоксина от 1 мг / мл коммерческого источника в фосфатно-солевом буфере (PBS) до конечной 10-кратным рабочего запаса путем разбавления с терминальной дифференцировки массовой информации.
6. Инициировать интоксикации добавлением 10 мкл 10х BoNT / фондовой в скважинах, предназначенных для лечения и низкий сигнал управления, используя многоканальную пипетку (рисунок 2). Лечить скважин, отнесенные высокой контроля с одних СМИ.
7. Дезактивации все пластиковую посуду и другие одноразовые, что приходит в соприкосновение с BoNT / A в ходе исследования путем погружения в 0,825% раствора гипохлорита в воде в течение по крайней мере 20 мин. Выполните все процедуры в кабинетах биобезопасности и обеззараживания рабочие зоны до и после экспериментов с 5% моющего средства дезинфицирующим моющим средством, таких как раствор Microchem.
8. Этикетка пластины четко обозначить использование токсина и incubели пластины обрабатывают 1 нМ / л BoNT / A в течение 4 ч при 37 ° С и _6% CO2 в инкубаторе для клеточных культур. Дисплей соответствующее обозначение сообщить коллегам, что токсин используется в лаборатории.
9. Стоп BoNT / протеолитическое расщепление с помощью метанола фиксации. Удалить средах, содержащих токсин и соединений из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки и выбросить в 10% -ного раствора хлорной извести. Добавить ледяной метанола (100 мкл) непосредственно в каждую лунку.
10. Инкубируйте пластин в течение 15 минут при комнатной температуре (RT), чтобы позволить происходить фиксации.
11. После фиксации, безопасного обращения отброшенные реагентов (считается обезврежены) с 1 протоколов уровня биобезопасности и выбросить соответственно.
12. Откажитесь метанола и использовать 100 мкл PBS, чтобы промыть клетки и увлажняет их до иммунной. Выполните два дополнительных промывок PBS.
13. После последней промывки, не оставляют PBS в колодцы, уплотнительные пластины с микропланшет клейкой пленкой и хранить при температуре 4 ° С до анализа. Храните пластины при 4 ° С FOг несколько дней.

2. Иммуноокрашивание

Процедура иммуноокрашивание является трудоемким, многоступенчатая операция, которая включает в себя повторяющиеся реагентов циклов дозирования / набирая и обширный мытье плиты, которые могут привести к потенциальному введению значительной внутриплитного и межплитного изменчивости. Полуавтоматическое подход применяется, чтобы сохранить время лабораторного персонала, повысить анализа пропускной и минимизировать иммуноокрашивания изменчивость.

1. Используйте автоматизированное рабочее место, оснащенный головкой 96-луночного способный переносить объемы до 250 мкл и интегрирован с роботизированной захвата рукой, чтобы переместить лабораторное оборудование в разных местах на модульной палубе (см Материал и оборудование) для этого протокола.
   1. Модульная палуба предназначена для размещения различных видов лабораторного оборудования и может поддерживать до 11 пунктов в любой момент времени. Автоматизированная обработчик микропланшет оснащен двойной журнала микропланшетного укладчика, чтобы удержать иманипулировать до 50 пластин в цикле.
   2. Автоматизированное рабочее место находится внутри шкафа класса II биобезопасности, предназначенного для оборудования автоматизации лабораторных обеспечить стерильность и безопасность. Для автоматизированного иммуноокрашивания, колода расположены, как показано на рисунке 3, чтобы обеспечить доступ реагентов по мере необходимости и без участия человека.
2. Предварительная нагрузка плиты, содержащие фиксированные клетки в пластине журнала и передачи на палубу, сколько необходимо для операций с жидкостями. Используйте 96 пипетки голову, оснащенный 250 мкл советы для аспирации PBS из скважин до 10 мкл. Проницаемыми клеточные мембраны, чтобы облегчить связывания антитела с внутриклеточных мишеней с пермеабилизации буфера (0,1% Тритон Х-100). Разлить проницаемости буфер (100 мкл) в каждую лунку перед возвращением пластины ко второму хранения журнала в микропланшет-укладчика для 15-минутной инкубации при комнатной температуре (RT).
3. Снимите буфер проницаемости и реrform пластины промывают PBS (дважды), как описано выше в шаге 1,13.
4. После последней стадии промывки, удалить PBS буфера и обойтись 100 мкл блокирующего буфера, содержащего 1% лошадиной сыворотки и 0,1% Tween 20 в PBS в микропланшетах все перед их возвращением к пластине журнала в течение 1 часа инкубации при комнатной температуре.
5. Использование двух первичных антител для иммунным окрашиванием: кроличьей поликлональной анти-мыши BACS антитела, для обнаружения полной длины SNAP-25 и мышиное моноклональное анти-III тубулина антитела для выявления нейронов (см материалы и оборудование). После 60 мин инкубации, удалить блокирующем буфере и выдачи 50 мкл 4ug / мл антитела БАКС и 0,5 мкг / мл III-тубулина в блокирующем буфере во все тарелки.
6. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре удалить первичных антител и промыть 3 раза 100 мкл PBS, содержащим 0,05% Tween (PBST).
7. Используйте IgG анти-мыши с надписью с Alexa Fluor 647 визуализировать -III тубулина и анти-кролик IgG с меткой Alexa Fluor 568 визуализировать антитела BACS. Подготовьте оба антитела, как разбавление / мл в 2 мкг в блокирующем буфере и выдачи 50 мкл смеси в каждую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: вторичные антитела, отобранные для иммуноокрашивания помечены разными флуорофорами, чтобы обнаружить их, испускаемого флуоресцентного света на различных длинах волн, используя различные каналы в детекторе за высокого содержания Imager.
8. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Аспирата вторичные антитела и промыть 3 раза 100 мкл PBST.
9. После последней промывки, добавляют 100 мкл PBS, содержащего краситель Hoechst (32 мкМ), чтобы окрасить ДНК для обнаружения ядер.
10. Уплотнение тарелки с легкой непроницаемой пленкой, чтобы защитить флуорофоры от фотообесцвечивания. Плиты можно хранить на 4   ° C в течение нескольких недель без значительной потери сигнала.

3. изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните сканирование изображения с помощью высокого содержания образами Sysма (См материалы и оборудование).

1. Спецификация высоких Определения тепловизора контента:
   1. Выберите тип плиты, планировка, количество полей, цель: Greiner у ясно, 96 Формат хорошо, 16, 20Х воды соответственно.
   2. Выбор каналов: ядро ​​EX возбуждения: 405 нм, как канал 4; цитоплазма EX: 644 нм, как канал 2; антигенспецифичной канал антитела EX: 561 нм, как канал 3 и Настройка мощности возбуждения каждого лазера, установки эксперимент как 2 экспозиций, экспозиции 1 с одной возбуждения на 644 нм, экспозиция 2 с двумя возбуждений на длине волны 405 нм и 561 нм. Выберите биннинга как BIN2.
   3. Используйте высокие скважин управления для оптимизации экспозиции с максимальной интенсивностью, как SNAP-25 канал и низких скважин управления для минимальной интенсивности.
   4. Регулировка экспозиции, так что интенсивность каждого канала составляет около половины от уровня насыщения (2000-2500 относительных единицах).
   5. Определить оптимальный Z самолет на маски клеток канала с помощью дельта-скрипт коррекции. См Fiцифра 5 результатов после иммуноокрашивания и визуализации. Экспорт данных на сервер, где программное обеспечение для анализа изображения, проживающего.

4. Анализ изображения (рисунок 6)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают применение программных алгоритмов Коламбус.

1. Выберите подходящий алгоритм для сегмента первичные объекты (ядра). При необходимости, отрегулируйте фона порог и параметры контрастности. Программное обеспечение Колумб обеспечивает 4 методы обнаружения ядра. Выберите метод, который сегмент ядра точно по визуальном осмотре сегментированные ядра (в F метода igure 6а М выбран).
2. Выберите алгоритм аксонов (CSIRO нейритов Analysis 2) в сегмент нейриты При необходимости отрегулировать фон пороговые и контрастные параметры, чтобы удалить фон. Смотрите рисунок 6b для параметров, используемых для обнаружения нейриты.
3. Определить нейрита регионы (сегменты нейритов) басред на вторичных объектов (невриты), используя -3 расширение пикселя тубулина канала β-III (Alexa муки 640) как маски (рис 6в).
4. Рассчитать интенсивность сигнала каналов (SNAP-25, (Alexa Мука 568) для региона невриты и тубулина канала β-III (рис 6d и 6е).
5. Выберите необходимые параметры для экспорта, такие как длина аксонов, средних интенсивностей SNAP-25, β-III тубулина, номер ядер, невритного номера сегмента и т.д. (рис 6f).
6. Передача плиты из листоукладчики использованием робота и загрузить в высокое содержание тепловизора для получения изображения.

5. Анализ данных:

Для оценки надежности проектируемого анализа, рассчитать следующие параметры из эксперимента пластины основе.

1. Сигнал (S) для фона (B): S / B = средняя интенсивность высокой контроля сигнала) / средняя интенсивность низкой контроля сигнала
<Li> Коэффициент вариации (КВ) сигнала и фона (для измерения равномерности конкретного сигнала): CV = (стандартное отклонение (SD) / среднее образца) * 100 (%), чтобы определить изменчивость в жидкой обработки, реагентов и т.д.
2. Сигнал-шум: S = (средняя интенсивность сигнала - средняя интенсивность низкой контроля сигнала) / SD низкого контроля
   1. Рассчитать коэффициент в Z 'с опьянением половины 96-луночного планшета в и макет опьянения другой половины. Z '= 1 - 3 * (SD высокой контроля сигнала + SD низкого сигнала управления) / (имею в виду высокого контроля сигнала - среднее низкой контроля сигнала). Для дальнейшего анализа данных скрининга, нормализуют некоторые из основных исходных параметров на пластине основе, чтобы позволить сравнение между пластинами и между различными экспериментами дней.
3. Процент расщепления, что свидетельствует о снижении сигнала, связанного с полной длины SNAP-25 обнаружено специфических антител (БАКС): Расщепление% = 100% * (MEAн интенсивность высокой контроля сигнала - интенсивность образца) / средняя интенсивность высокой контроля сигнала.
4. Процент ингибирования расщепления:% ингибирования = 100% * (интенсивности образца - значит, интенсивность низкого сигнала управления) / (средняя интенсивность высокой контроля сигнала - средняя интенсивность низкой контроля сигнала).

Данные из высоких и низких управления создали две различные популяции с разницей в два медианы более 3 стандартных отклонения (7А). Цель процесса отбора является найти соединений в пределах выборки населения со значениями ближе к положительной контрольной популяции, предполагая нормальное распределение среди населения образца (рис 7В, (я)). Точки данных, которые являются 3 стандартных отклонения за пределы среднего считаются статистически отличается от шума и классифицированы в качестве активного "Hit" (фиг.7В (II), красные коробки). Соединения, которые классифицируются как "хитов" будут подвергнуты дальнейшей проверки подтверждения в дальнейших исследованиях. 7В (б) показано обнаружение положительных хитов в популяции образцов от представительного подмножества экранирующих пластин. Все 4 балла, что имели значения ниже (в среднем образцов - 3 * SD образцов) принадлежалито же самое ингибитор, который был замечен в разных местах в пределах 4-х различных экранирующих пластин. Этот ингибитор продемонстрировали надежный SNAP-25 защищает от BoNT / A, как показано на рисунке 5.

Рисунок 1: Последовательность действий для соединения скрининга в анализе BoNT / HCI.

На рисунке 2:. Карта 96-луночный планшет для анализа HCI высокого контрольные лунки (розовый) обрабатывали 0,5% ДМСО в качестве контроля и только низких контрольных лунках (синий) обрабатывали 1 нМ BoNT / A и 0,5% ДМСО. Примеры скважины (зеленый) обрабатывали 1 нм токсина и 10 мкМ соединений в 0,5% ДМСО. Наружные столбцы и строки (серого цвета) не были использованы из-за несовместимости с оптимизированной пластины дляковрик и неспособность 20X воды погружения целью краевых изображение скважин.

На рисунке 3:. Конструкция АРМ палубе для анализа иммунным окрашиванием блокирующем буфере, первичное антитело, и вторичное антитело клеточные пятна были распределены в 96-луночных полипропиленовых, чтобы уменьшить мертвое пространство потерю реагентов. PBS, был разлит в лоток, способный удерживать 300 мл. Коллектор используется для аспирации жидких отходов показана на вставке изображения.

Рисунок 4: Снимок экрана высокое содержание тепловизора экспериментальной установки.

нг> Рисунок 5:. Высокое содержание визуализации SNAP-25 расщеплению в мышиных ES-двигательных нейронов происходит Клетки обрабатывали 1 нМ BoNT / A с и без добавления 1 мкМ ингибитора (Toosendanin) ¹⁴ или отсутствие лечения без токсина. SNAP-25 был обнаружен с антителом БАКС. В другом канале, нейроны были обнаружены с использованием β-III-тубулина антитела для создания маски для нейритов SNAP-25 анализа изображений. Это один представитель изображение одного из 16 снимков, сделанных с учетом хорошо. Синий цвет обозначает ядер, окрашенных Hoechst 33342, красный сигнал BACS и зеленый является β-III-тубулина сигнал. Изображения были получены с Opera, как описано. Размер бар: 10 мкм

Рисунок 6: Скриншоты, показывающие различные этапы анализа изображений трубопровода.

Высокая эффективность ботулинического нейротоксина и относительной легкости их милитаризации привело их отнесения к категориям А (самый высокий приоритет) biothreat агентов по Центров США по контролю и профилактике заболеваний. К сожалению, не существует FDA не утвердил терапевтические противостоять BoNT интоксикацию после токсин был усвоен двигательных нейронов. Любой druggable механизм, который способствует нейронов восстановление от ботулинического токсина опьянения может привести к развитию потенциального терапии чтобы защитить и видов Вооруженных Сил и общественности против этой биологической угрозы. В этой статье мы представляем подробный протокол анализа HCI для скрининга ингибиторов летальных токсинов, таких как BoNT / A. Необычный аспект данного анализа является скрупулезное вручение токсинов и реализации строгих протоколов биобезопасности для обеспечения безопасности лабораторий. Особую осторожность следует проявлять в то время как активный токсин находится в использовании. BoNT / A инактивации с помощью метанола и фиксации микропланшетов decontaminatiна 10% отбеливателя и 5% поверхности салфетки являются ключевыми шагами, которые позволяют планшетов, которые будут удалены из шкафов биобезопасности для последующей оценки в области биобезопасности уровень 2 лабораторных условиях.

В связи с постоянно расширяющейся размера библиотек соединений в сочетании с медленным расширением двигательного нейрона (количество клеток), HCI анализы для нейротоксина антагонистов, как правило, работать в течение нескольких недель. Это требует, чтобы вариабельность между пластинами и во времени должны быть устранены или сведены к минимуму. В этом протоколе мы предоставляем методы автоматизации для иммуноокрашивания, получения изображений и анализа, чтобы уменьшить изменчивость анализа. Далее надежность и последовательность может быть достигнуто за счет автоматизации рутинных операций, связанных с этим протоколом, включая обшивки клеток, промывки, и фиксации. Наша группа в настоящее время оценивает влияние этих усовершенствований с целью их включения в нашем протоколе в ближайшее время.

В этом докладе мы описываем SNAP-25Расщепление анализ с использованием изображений с высоким содержанием измерить относительную флуоресценцию неповрежденной SNAP-25 в двигательных нейронов. Этот анализ использует BACS и β-III тубулина антител для обнаружения в полный рост SNAP-25 и β-III тубулина соответственно ^11. β-III тубулина используется в качестве маркера для конкретно определить нейроны (рисунок 4). В то время как BoNT / A расщепляет SNAP-25 и снижает SNAP-25 сигнал, малые молекулы, которые ингибируют любую часть этого процесса улучшения SNAP-25 сигнал в анализе изображений. Как этот анализ зависит от флуоресцентного сигнала, генерируемого от SNAP-25, распределенных по многим крошечных нейритах, высокое качество изображения являются абсолютно необходимыми. Следовательно, автоматизированные микроскопы, которые производят конфокальной изображения с высоким разрешением рекомендуется (рисунок 4). Мы обычно 6-16 захватить полей / лунку в формате 96-луночного при использовании 20X вода-иммерсионный объектив. Количество распечатанных месторождения зависят от общего числа нейритах необходимых для Generatе статистически значимые результаты.

Модульные алгоритмы анализа изображений были использованы для извлечения многопараметрических данных (Рисунок 6). Алгоритмы модульная анализа изображений Columbus сравнительно легко произвести для простых сценариев анализа. Для более сложного анализа или проектирования конкретных параметров для сложных показаний, скрипты, основанные акапелла можно использовать в среде Opera, а также внутри контексте Колумба. В дополнение к интенсивности флуоресценции, полученных из тубулина каналов SNAP-25 и β-III, мы обычно собирают другие параметры, такие как общего числа клеток (косвенной мерой для цитотоксичности), длины нейритов, нейрита разветвления и других конечных точек для количественного нейронов здоровья во время Анализ. Необработанные данные конечных точек экспортируются в статистическое программное обеспечение анализа для дальнейшего анализа данных и ударил отбора (рисунок 7). Данные, представленные здесь демонстрирует способность анализа HCI быть efficiвидимому используются для фенотипического скрининга в поиске ингибиторов BoNT / A с использованием физиологически соответствующую модель двигательных нейронов.