Een hoog gehalte Imaging Assay voor Identificatie van botulineneurotoxine Remmers

De bacterie Clostridium botulinum produceert Botulinum neurotoxine, een van de meest potente biologische toxinen die de mens ^1. Er zijn 7 verschillende BoNT serotypen (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induceren verlamming bij de neuromusculaire junctie door SNARE complex proteolyse ^2,3. SNARE proteolyse voorkomt neurotransmitter blaasje-membraan fusie en daardoor blokkeert de exocytose van neurotransmitters ^4. De specifieke SNARE doel hangt af van de specifieke BoNT serotype betrokken bij de intoxicatie proces. BoNT / A en BoNT / E cleave SNAP-25 terwijl BoNT / C splitst zowel SNAP-25 en syntaxine ^5. De overblijvende serotypen splitsen synaptobrevine (ook wel bolletjes geassocieerde membraaneiwit (VAMP). BoNT / A is gekozen assay ontwikkeling is verantwoordelijk voor een groot deel van natuurlijk voorkomende botulisme en de langste werkingsduur ^6. Ontwikkeling van moleculen geneesmiddelen tegen BoNT / A is een belangrijk doel vooronze drug discovery programma en heeft traditioneel-target-gebaseerde methoden gebruikt om de actieve site proteolytische remmers ^{7 identificeren, 8-10.} Echter, zal de oprichting van de actieve site inhibitoren met breed spectrum activiteit tegen verschillende serotypes en post-exposure werkzaamheid waarschijnlijk uitdagend.

We hebben daarom werd een innovatieve, fenotypische drug discovery aanpak die BoNT SNAP-25 splitsing gebruikt als een functionele eindpunt aan kleine moleculen die BoNT-gemedieerde motor neuron intoxicatie kan blokkeren identificeren. SNAP-25 is nodig voor neurotransmitters, zoals afbraak van SNAP-25 is voorspellend verlamming en letaliteit in vivo. Bijvoorbeeld zou celgebaseerde screening tot ontdekking van nieuwe modulatoren van cellulaire factoren die verantwoordelijk zijn voor toxine inactivering of remming van toxine trajecten binnen doelcellen. Een belangrijke factor in fenotypische assay ontwikkeling is de selectie van fysiologisch relevante biologische modellen. We en anderen hebben muis embryonale stamcellen (ES) cellen afgeleide motorische neuronen die de immunologische karakter van de primaire motorische neuronen recapituleren en het uiten van Onverwacht-25 ^{11- 13} beschreven. Belangrijk, deze cellulaire systemen zijn zeer gevoelig voor BoNT / A intoxicatie en tonen dosis-afhankelijke splitsing van SNAP-25 in reactie op toenemende concentraties van toxine ^11,12. De gedifferentieerde neuronen worden ook geproduceerd in hoeveelheden die voldoende zijn voor high throughput plaat gebaseerde analyse en kon de vormgeving van een array van cellulaire assays.

De fenotypische test is een immunofluorescentie methode gebruik te maken van twee verschillende antilichamen tegen splitsing van endogeen tot expressie volledige lengte SNAP-25 te kwantificeren tijdens BoNT / Een roes van muis motor neuron cultuur. Een carboxyleindstandige BoNT / A decollete-gevoelige (BACS) antilichaam dat alleen volledige lengte SNAP-25 herkent, worden nagegaan of BoNT / A gemedieerde proteolyse van SNAP-25uitdrukking in muismotorneuronen ^10. Een schematisch diagram van de HCI assay is weergegeven in figuur 1.

Plate 20.000 gedifferentieerde muis ES-cellen (MES) / putje in een 96 well Poly-D-lysine gecoate platen en in motor neuron terminale differentiatie media te behouden gedurende 5-7 dagen.

1. Compound Administratie en intoxicatie met BoNT / A

Voer elk van de volgende werkzaamheden in een BSL2 behuizing om de naleving van CDC / NIH richtlijnen te houden.

1. Bereid 10 mM voorraadoplossingen van elke bibliotheek verbinding in 100% DMSO in polypropyleen platen met 96 putjes. Gebruik de 10 mM voorraad naar een tussenliggende plaat verdunning die 10 maal hoger dan de gewenste concentratie screening bereiden. Bereid 100 uM tussenplaat door doseren 10 mM voorraad in 96-well plaat en verdunnen tot 100 uM behulp voedingsbodems. Pipetteer 10 ul van de verbindingen op 90 ul van media op de cellen ^11. Test verbindingen bij 10 uM eindconcentratie en zorgen uiteindelijk percentage van DMSO ten hoogste 0,5%.
2. Voer alle studies dat levende cellen en actieve toxine te gebruiken onder bioveiligheid niveau 2 voorwaarden. Vervang het medium in de 96-well platen met 80 ul vers terminale differentiatie media met een 12 kanaals handmatige pipet. Voer aspiratie en breng stappen rijen blootstelling van de cellen te voorkomen zonder media aan de omgevingslucht.
3. Voorbehandelen cellen met verbindingen vóór toepassing van toxine door toevoeging van 10 pl van 10x verbindingen uit de bronplaat met een 12 kanaals pipet, gevolgd door mengen door afzuiging (tweemaal). Voor elke 96-well plaat, behandel twee kolommen 6 putjes met 10x DMSO verdund in de media zo hoog signaal en lage signaal controles dienen. De kolom zonder BoNT behandeling vertoont het hoogste niveau van de volledige lengte SNAP-25 (hoog signaal controle). Behandel de andere kolom met BoNT alleen (zonder verbindingen) als het lage signaal controle. Met lage controle om de efficiëntie van BoNT splitsing van SNAP-25 en de detectie met de BACS antilichaam waarnemen (Figuur 2).
4. Incubeer cellen met verbindingen gedurende 30 min bij 37 ° C en 6% _CO2 in de celkweek incubator.
5. Bereid botulineneurotoxine Een uit een 1 mg / ml commerciële bron in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een uiteindelijke 10x werkvoorraad door verdunnen met terminale differentiatie media.
6. Initiëren intoxicatie door toevoeging van 10 pl 10x BoNT / A stock in putten aangewezen voor behandeling en lage signaal controles met een meerkanaalspipet (figuur 2). Behandel de aangewezen als high-controle met alleen media putten.
7. Ontsmet alle plastic waren en andere disposables die in contact komt met BoNT / A tijdens de studie door onderdompeling in 0,825% hypochloriet oplossing in water gedurende minstens 20 minuten. Voer alle procedures in bioveiligheid kasten en ontsmetten werkruimtes, zowel voor als na experimenten met 5% detergent desinfecterende reiniger zoals MicroChem oplossing.
8. Label de platen duidelijk te maken en incub toxine te duidenat platen behandeld met 1 nM / L BoNT / A gedurende 4 uur bij 37 ° C en 6% _CO2 in een celkweek incubator. Toon passende bewegwijzering naar collega's die toxine in gebruik is in het laboratorium op de hoogte.
9. Stop BONT / A proteolytische splitsing door methanol fixatie. Verwijder media met toxine en verbindingen uit elk putje met een multichannel pipet en gooi in 10% bleekwater oplossing. Voeg ijskoude methanol (100 ui) rechtstreeks aan elk putje.
10. Incubeer de platen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) om fixatie te voorkomen.
11. Na fixatie, veilig omgaan met de afgedankte reagentia (beschouwd geneutraliseerd) met bioveiligheid niveau 1 protocollen en dienovereenkomstig weggooien.
12. Gooi methanol en gebruik 100 pl PBS om de cellen te wassen en ze te rehydrateren voor immunokleuring. Voer twee extra wassen met PBS.
13. Na de laatste wasbeurt, laat PBS in de putjes afdichting platen met microplaat kleeffolie en bewaar bij 4 ° C tot analyse. WINKEL platen bij 4 ° C for een aantal dagen.

2. Immunokleuring

De immunostaining procedure is een arbeidsintensieve, multistep operatie die repetitieve reagens dispensesystemen / aspireren cycli en uitgebreide plaat wassen die kunnen leiden tot de mogelijke invoering van belangrijke intraplaat en Interplate variabiliteit omvat. Een semi-automatische benadering wordt toegepast op het tijdstip van het laboratoriumpersoneel besparen, throughput assay en minimaliseren immunokleuring variabiliteit.

1. Gebruik een geautomatiseerd werkstation voorzien van een 96-well head kunnen overbrengen volumes tot 250 ul en geïntegreerd met een robot grijper arm laboratorium verplaatsen naar verschillende locaties op het modulaire dek (zie Materialen en uitrusting) voor dit protocol.
   1. De modulaire dek is ontworpen om verschillende typen laboratorium gastheer en kan tot 11 items ondersteunt tegelijkertijd. De geautomatiseerde microplaat handler is voorzien van een dubbel magazijn microplaat stacker teneinde houden enmanipuleren tot 50 platen per cyclus.
   2. De geautomatiseerde werkstation bevindt zich in een klasse II bioveiligheid kast ontworpen voor laboratoriumautomatisering apparatuur steriliteit en veiligheid. Voor geautomatiseerde immunokleuring, wordt het dek opgesteld als aangegeven in figuur 3 om toegang reagens als nodig en zonder menselijke tussenkomst mogelijk.
2. Pre-load platen met vaste cellen in de plaat magazine en transfer naar het dek als nodig is voor liquid handling operaties. Gebruik de 96 pipetkop uitgerust met 250 ul tips om te zuigen PBS uit de bronnen tot 10 pl. Permeabilize celmembranen antilichaam vergemakkelijken binding aan intracellulaire doelwitten met permeabilisatie buffer (0,1% Triton-X 100). Verdeel permeabilisatie buffer (100 ui) in elk putje, voordat de platen bij de tweede opslag magazijn van de microplaat stapelaar 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur (RT).
3. Verwijderen permeabilisatie buffer en perform plaat wassen met PBS (tweemaal) zoals eerder beschreven in stap 1.13.
4. Na de laatste wasstap, verwijder de PBS-buffer en afzien 100 ul van het blokkeren van een buffer met 1% paard serum en 0,1% Tween 20 in PBS in alle microplaten alvorens terug te keren ze naar de plaat magazine voor 1 uur incubatie bij kamertemperatuur.
5. Gebruik twee primaire antilichamen voor immunostaining: een konijn polyklonale anti-muis BACS antilichaam, voor de detectie van de volledige lengte van SNAP-25 en een muis monoklonaal anti-III tubuline antilichaam voor detectie van neuronen (zie materiaal en apparatuur). Na 60 min incubatie, verwijder blokkeerbuffer en breng 50 pl 4UG / ml BACS antilichaam en 0,5 ug / ml-III tubuline in blokkerende buffer in alle platen.
6. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur verwijdert de primaire antilichamen en was 3 maal met 100 pi PBS dat 0,05% Tween (PBST).
7. Gebruik van een anti-muis IgG gelabeld met Alexa Fluor 647 de-III tubuline en anti-konijnen IgG gelabeld met Alexa F visualiserenluor 568 aan de BACS antilichaam visualiseren. Bereid zowel antilichamen als 2 ug / ml verdund in blokkeerbuffer en breng 50 pl van het mengsel in elk putje.
   OPMERKING: De secundaire antilichamen gekozen voor immunokleuring worden gelabeld met verschillende fluoroforen op detectie van de uitgestraalde fluorescerend licht laat bij verschillende golflengtes met verschillende kanalen binnen de detector van het hoge gehalte Imager.
8. Incubeer gedurende 1 uur bij KT. Zuig het secundaire antilichamen en was 3 maal met 100 pi PBST.
9. Na de laatste wasbeurt, voeg 100 ul PBS die Hoechst kleurstof (32 uM) aan het DNA voor kernen detectie vlek.
10. Dicht de platen met een licht ondoorlaatbare film naar de fluoroforen beschermen tegen fotobleken. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4   ° C gedurende weken zonder significant verlies van signaal.

3. Imaging

OPMERKING: Voer beeldaanwinst behulp van High Content Imaging Systeem (zie materialen en apparatuur).

1. Specificatie van High Content Imager definities:
   1. Selecteer type plaat, lay-out, het aantal velden, objectief: Greiner u duidelijke, 96 well formaat, 16, respectievelijk 20X water.
   2. Kies kanalen: nucleus excitatie EX: 405 nm als kanaal 4; cytoplasma EX: 644 nm als kanaal 2; antigeen-specifieke antilichaam kanaal EX: 561 nm als kanaal 3 en Opzetten excitatie kracht van elke laser, Setup experiment als 2 belichtingen, Exposure 1 met een excitatie bij 644 nm, Belichting 2 met twee excitaties bij 405 nm en 561 nm. Selecteer binning als BIN2.
   3. Gebruik hoge controle putten voor blootstelling optimalisatie met maximale intensiteit als SNAP-25 kanaal en lage controle putten voor een minimale intensiteit.
   4. Pas de belichting, zodat de intensiteit van elk kanaal is ongeveer de helft van het verzadigingsniveau (2000-2500 relatieve eenheden).
   5. Identificeer de optimale Z-vlak op mobiele masker kanaal met delta correctie script. Zie Figuur 5 voor resultaten na immunostaining en beeldvorming. Gegevens naar de server waar de software voor beeldanalyse verblijft export.

4. beeldanalyse (figuur 6)

OPMERKING: De volgende stappen beschrijven de toepassing van de Columbus software-algoritmen.

1. Selecteer een geschikte algoritme om het segment van de primaire objecten (kernen). Indien nodig, aan te passen achtergrond drempel en contrast parameters. De Columbus-software biedt 4 kernen detectiemethoden. Kies de methode die het segment kernen nauwkeurig door visueel te inspecteren gesegmenteerd kernen (in F igure 6a methode M is geselecteerd).
2. Selecteer de neuriet algoritme (CSIRO Neuriet Analyse 2) naar het segment van de neurites Indien nodig, aan te passen achtergrond drempel en contrast parameters om de achtergrond te verwijderen. Zie Figuur 6b voor parameters die worden gebruikt om neurites detecteren.
3. Identificeer de neuriet regio (neuriet segmenten) based op secundaire objecten (neurieten) met een -3 pixel uitbreiding van de β-III tubuline kanaal (Alexa Flour 640) als masker (figuur 6c).
4. Bereken intensiteit van het signaal kanalen (SNAP-25, (Alexa Flour 568) voor de neurieten regio en β-III tubuline kanaal (figuur 6d en 6e).
5. Selecteer de gewenste parameters voor de export, zoals neuriet lengte, gemiddelde intensiteiten van SNAP-25, β-III tubuline, kernen nummer, neuriet segment nummer, enz. (Figuur 6f).
6. Transfer platen uit plaat stackers met behulp van de robot en de lading in de High Content Imager voor het acquisitie.

5. Data-analyse:

Om de robuustheid van de ontworpen test beoordeelt Bereken de volgende parameters van de plaat experiment brengt.

1. Signaal (S) naar de achtergrond (B): S / B = gemiddelde intensiteit van hoge signaal-controle) / gemiddelde intensiteit van lage signaal controle
<li> variatiecoëfficiënt (CV) van het signaal en de achtergrond (de uniformiteit van het signaal te meten): CV = (standaardafwijking (SD) / gemiddelde van monster) x 100 (%), om de variabiliteit te bepalen vloeistofverwerking, reagentia, etc.
2. Signal to Noise: S = (gemiddelde intensiteit van het signaal - gemiddelde intensiteit van lage signaal controle) / SD van lage controle
   1. Bereken de Z 'factor intoxicatie van één helft van een 96-well plaat en een mock intoxicatie van de andere helft. Z '= 1-3 * (SD van hoge signaal control + SD van lage signaal controle) / (gemiddelde van hoge signaal control - gemiddelde van lage signaal controle). Voor de verdere analyse van de screening gegevens normaliseren enkele primaire grondstoffen parameters op een plaat basis om vergelijking tussen platen en tussen verschillende dagen experimenten.
3. Percentage van splitsing, die de vermindering van het signaal geassocieerd met volledige lengte SNAP-25 gedetecteerd door specifieke antilichamen (BACS):% Splitsing = 100% * (mean intensiteit van hoge signaal-controle - intensiteit van het monster) / gemiddelde intensiteit van hoge signaal controle.
4. Procent van Remming van splitsing:% Remming = 100% * (intensiteit van het monster - gemiddelde intensiteit van lage signaal controle) / (gemiddelde intensiteit van hoge signaal control - gemiddelde intensiteit van lage signaal controle).

Gegevens van hoge en lage controle gecreëerd twee verschillende populaties met het verschil van twee medianen dan 3 standaardafwijkingen (figuur 7A). Het doel van de screening is om de verbindingen in het monster populatie vinden waarden dichter positieve controlegroep, uitgaande van een normale verdeling in het monster populatie (figuur 7B, (i)). Datapunten 3 standaardafwijkingen boven de gemiddelde worden geacht statistisch verschillend van het lawaai en geclassificeerd als een actief "hit" (Figuur 7B (ii), rode dozen). De verbindingen die als "hits" worden onderworpen aan verdere tests toekomstige studies bevestigd. Figuur 7B (ii) toont de detectie van positieve hits in de populatie van de monsters van een representatief deel van de zeefplaten. Alle 4 punten waarden had lager dan de (mediaan monsters - 3 * SD van de monsters) wasdezelfde remmer die werd gespot op verschillende locaties binnen de 4 verschillende screening platen. Deze remmer toonde robuuste SNAP-25 bescherming tegen BoNT / A, zie figuur 5.

Figuur 1: Werkstroom voor samengestelde screening BoNT / A HCl assay.

Figuur 2. De 96-well plaat map voor assay HCI Hoge controleputjes (roze) werden behandeld met 0,5% DMSO als enige en lage controleputjes (blauw) werden behandeld met 1 nM BoNT / A en 0,5% DMSO. Monsterhouders (groen) werden behandeld met 1 nM en 10 uM toxine van verbindingen in 0,5% DMSO. De buitenste kolommen en rijen (grijs) werden niet gebruikt als gevolg van incompatibiliteit met de geoptimaliseerde plaat voormat en het onvermogen van de 20X water-immersie objectief met image rand putten.

Figuur 3:. Het ontwerp van het geautomatiseerde werkstation dek voor de immunokleuring assay Blokkeringsbuffer, primair antilichaam, secundair antilichaam en cellulaire vlekken werden verdeeld in 96-well polypropyleen platen dood volume reagens verminderen. PBS werd verdeeld in een lade kunnen houden 300 ml. Het spruitstuk gebruikt voor afval aspiratie vloeistof wordt getoond op de afbeelding van de inzet.

Figuur 4: Screen shot van het hoge gehalte Imager experimentele opgezet.

ng> Figuur 5:. Hoog gehalte beeldvorming van SNAP-25 splitsing in muizen ES-afgeleide motorneuronen Cellen werden behandeld met 1 nM BoNT / A met en zonder toevoeging van 1 uM remmer (Toosendanin) ¹⁴ of onbehandeld gelaten zonder toxine. SNAP-25 werd gedetecteerd met de BACS antilichaam. In een ander kanaal, werden neuronen gedetecteerd met behulp van een β-III-tubuline antilichaam aan masker van neurites voor SNAP-25 beeldanalyse maken. Dit is een representatief beeld van één van de 16 beelden uit een bepaalde put. Blauw geeft kernen gekleurd met Hoechst 33342, rood is de BACS signaal en groen is de β-III-tubuline signaal. Beelden werden verkregen met de opera beschreven. Grootte bar: 10 pm

Figuur 6: Screenshots tonen verschillende stappen in beeldanalyse pijplijn.

De hoge potentie van botulinum neurotoxinen en het relatieve gemak van hun bewapening heeft geresulteerd in hun indeling in categorie A (hoogste prioriteit) biothreat agenten door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention. Helaas zijn er geen FDA goedgekeurde therapieën voor BoNT intoxicatie tegen nadat het toxine wordt geïnternaliseerd door de motorneuronen. Elke druggable mechanisme neuronale herstel van BoNT intoxicatie bevordert leiden naar de ontwikkeling van een potentiële therapie voor zowel het leger en het publiek te beschermen tegen deze biologisch gevaar. In dit artikel presenteren wij een gedetailleerde HCl assay protocol voor het screenen van remmers van dodelijke toxinen zoals BoNT / A. Een ongewoon aspect van deze test is nauwgezette overhandigen van toxines en de implementatie van strikte bioveiligheid protocollen om de veiligheid in laboratoria te verzekeren. Men moet uiterst voorzichtig worden uitgeoefend tijdens het actieve toxine in gebruik is. BoNT / A inactivatie via methanol fixatie en microplate decontaminatiop met 10% bleekwater en 5% oppervlakte doekjes zijn belangrijke stappen die het mogelijk maken microplaten te worden verwijderd uit de bioveiligheid kasten voor downstream evaluatie in bioveiligheid niveau 2 laboratorium omgevingen.

Door de steeds groeiende omvang van verbinding bibliotheken combinatie met langzame motor neuron uitbreiding (celaantal), HCI assays voor antagonisten neurotoxine meestal lopen over meerdere weken. Dit vereist dat de variabiliteit tussen de platen en in de tijd moet worden geëlimineerd of tot een minimum beperkt. In dit protocol geven we automatisering methoden voor immunostaining, het verwerven en analyseren om de assay variabiliteit te verminderen. Verdere betrouwbaarheid en consistentie kan worden bereikt door de automatisering van routinetaken in verband met dit protocol, met inbegrip cel plating, wassen, en fixatie. Onze groep is momenteel een evaluatie van de impact van deze verbeteringen, met de bedoeling ze op te nemen in ons protocol in de nabije toekomst.

In dit rapport beschrijven we een SNAP-25klievingstest behulp van hoge gehalte beeldvorming om relatieve fluorescentie van intacte SNAP-25 in de motorische neuronen te meten. Deze test gebruikt de BACS en β-tubuline III antilichamen met de volledige lengte SNAP-25 en β-tubuline III respectievelijk ¹¹ detecteren. β-tubuline III wordt gebruikt als een marker om specifiek neuronen (figuur 4) te identificeren. Terwijl BoNT / A splitst SNAP-25 en vermindert de SNAP-25 signaal, kleine moleculen die een deel van dit proces te remmen verbeteren SNAP-25 signaal in de imaging-test. Aangezien deze test hangt af van het fluorescentiesignaal gegenereerd uit de SNAP-25 verdeeld over vele kleine neurieten beelden van hoge kwaliteit zijn absoluut noodzakelijk. Daarom geautomatiseerde microscopen hoge resolutie confocale beelden produceren aanbevolen (figuur 4). We routinematig vastleggen 6-16 velden / putje in een 96 putjes format bij gebruik van de 20X water immersie objectief. Het aantal afgebeelde veld is afhankelijk van het totale aantal neurieten nodig generate statistisch significante resultaten.

Modulaire beeldanalyse-algoritmen werden gebruikt om multiparameter data (Figuur 6) uit te pakken. De Columbus modulaire beeldanalyse-algoritmen zijn relatief eenvoudig te genereren voor eenvoudigere analyse scenario. Voor meer gecompliceerde analyse of het ontwerp van specifieke parameters voor complexe uitlezing, kan Acapella gebaseerde scripts worden gebruikt binnen de Opera-omgeving als binnen de context van Columbus. Naast de fluorescentie-intensiteiten verkregen uit de SNAP-25 en β-III tubuline kanalen, we routinematig verzamelen andere parameters zoals het totale aantal cellen (indirecte maat voor cytotoxiciteit), neuriet lengte neuriet vertakking en andere eindpunten neuronale gezondheid kwantificeren tijdens de assay. De ruwe eindpunt gegevens worden geëxporteerd naar statistische analyse software voor verdere data-analyse en sloeg selectie (figuur 7). De hier gepresenteerde gegevens tonen het vermogen van de HCI assay effici zijnently gebruikt voor fenotypische screening op zoek naar BoNT / A-remmers met een fysiologisch relevante motor neuron model.