Summary

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

Published: August 25, 2014
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Summary

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Abstract

Cellule NG2 che esprimono (polydendrocytes, cellule precursori degli oligodendrociti) sono la quarta maggiore popolazione di cellule gliali nel sistema nervoso centrale. Durante lo sviluppo embrionale e postnatale che proliferano attivamente e generano oligodendrociti mielinizzanti. Queste cellule sono state comunemente studiate in colture primarie dissociate, co-colture di neuroni, e nel tessuto fisso. Utilizzo di recente disponibili linee di topi transgenici fetta sistemi di coltura possono essere utilizzati per studiare la proliferazione e la differenziazione delle cellule oligodendrociti lineage in entrambe le regioni grigi e bianchi questione di proencefalo e cervelletto. Culture fetta sono preparati dai primi topi postnatale e sono tenuti in coltura per fino a 1 mese. Queste sezioni possono essere esposte più volte nel corso del periodo di coltura per studiare il comportamento e le interazioni cellulari. Questo metodo permette la visualizzazione di divisione cellulare NG2 e le fasi che portano alla differenziazione degli oligodendrociti consentendo un'analisi dettagliata della regione dipendeent cellule NG2 e oligodendrociti eterogeneità funzionale. Questa è una tecnica potente che può essere usato per studiare i segnali intrinseci ed estrinseci che influenzano queste cellule nel tempo in un ambiente cellulare che si avvicina a quella trovata in vivo.

Introduction

Culture fetta Organoytpic del sistema nervoso centrale, hanno dimostrato di essere estremamente utile per lo studio dei neuroni e della biologia delle cellule gliali in un sistema semiintact 1 – 4. Queste culture sono relativamente semplici da adottare e mantenere molti benefici di colture primarie di cellule dissociate, come manipolazione dell'ambiente extracellulare e di facile accesso per i ripetuti a lungo termine imaging cellulare dal vivo e registrazioni elettrofisiologiche 5-9. Inoltre, culture fetta mantengono citoarchitettura tessuto 3-dimensionale, connettività neurale regionale, e la maggior parte dei tipi di cellule principali sono presenti nel sistema. Queste proprietà fanno di queste culture un sistema unico e conveniente per studiare il comportamento di singole cellule e fisiologia con interazioni cellulari e ambientali.

Cellule NG2 sono una popolazione di cellule gliali nel sistema nervoso centrale dei mammiferi che continuano a proliferare e generare myelinating oligodendrociti durante lo sviluppo embrionale e postnatale 10. Essi sono stati ampiamente studiati in colture cellulari primarie dissociate, e recente sviluppo di linee di topi transgenici con espressione specifica delle cellule NG2 di proteine ​​fluorescenti ha facilitato nella mappatura vivo destino e registrazioni elettrofisiologiche in fettine acute. Anche con questi studi, poco si sa circa le dinamiche temporali di proliferazione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti. Sebbene coltura cellulare dissociata è ampiamente usato per la relativa facilità di manipolazioni farmacologiche e genetiche, non è adatto per interrogare differenze funzionali di queste cellule in differenti regioni cerebrali in particolare quando è desiderabile mantenere contesto del microambiente cellulare. Culture fetta forniscono una semplice alternativa che è suscettibile di manipolazioni farmacologiche e sono stati utilizzati per indagare oligodendrociti mielinizzazione 11,12, cellulerisposta colare dopo lisolecitina (LPC) o di anticorpi indotta demielinizzazione 13,14, e l'induzione di rimielinizzazione tramite trattamento farmacologico 15.

Un metodo per indagare ed eseguire l'imaging dal vivo e tessuto fissato (o postfixation) analisi della proliferazione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti in culture fetta organotipica prelevati sia dal prosencefalo e il cervelletto è descritto. Questo è un metodo potente che può essere utilizzato per studiare il destino delle cellule di singole cellule NG2 dopo la divisione 16 e per scoprire le differenze o una regione e di età-dipendente in fattore di crescita NG2 indotta proliferazione cellulare 17. Questo relativamente semplice tecnica è ampiamente accessibile di approfondire intrinseca e / o ambientale cella meccanismi che regolano la fisiologia di queste cellule gliali e la loro risposta all'attività neuronale o danneggiamento della mielina.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sugli animali stanno seguendo le linee guida e sono stati approvati dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso l'Università del Connecticut. NOTA: Per questi esperimenti costitutive NG2cre 18 (JAX # 008533) e inducibile NG2creER 16 (JAX # 008538) topi transgenici attraversato dalla A alla Z / EG 19 (JAX # 003920) o gtRosa26: YFP giornalista 20 (JAX # 006148) linee, rispettivamente, sono stati utilizzati di immagine cellule NG2 e la lo…

Representative Results

Esempi di dati rappresentativi sono riportati qui di seguito, che sono stati ottenuti con culture fetta sia dal proencefalo e nel cervelletto di P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP e PLPDsRed linee di topi transgenici. Cellule NG2 possono essere esposte nei giorni in prosencefalo e cervelletto fette (Figura 1B-D, video 1) e il fenotipo di queste cellule può essere determinata dopo la fissazione e immunoistochimica con anticorpi NG2 e CC1 (Figura 1E). Oltre a vivere l'imaging, la prolifer…

Discussion

Mielinizzazione nel sistema nervoso centrale è essenziale per un'efficiente comunicazione neuronale e la sopravvivenza assonale 22. Cellule NG2 continuano a generare oligodendrociti mielinizzanti in età adulta, pur mantenendo una popolazione residente nella maggior parte delle regioni del cervello 16,23 – 25. Alcuni meccanismi genetici e molecolari che regolano il differenziamento di queste cellule sono state descritte, ma resta ancora molto da scoprire. Culture fetta organotipica sono un com…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.

Materials

Slice Culture Medium
Minimum Essential Medium Invitrogen 11090 50%
Hank’s Balanced Salt Solution Invitrogen 14175 25%
HEPES Sigma-Aldrich H-4034 25mM
L-Glutamine Invitrogen 25030 1mM
Insulin Sigma-Aldrich I6634 1mg/L
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A-0278 0.4mM
Horse Serum Hyclone SH30074.03 25%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaCl Sigma-Aldrich S3014 124mM
KCl Sigma-Aldrich P5405 3.004mM
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655 1.25mM
MgSO4 (anhydrous) Sigma-Aldrich M7506 4.004mM
CaCl2 2H2O Sigma-Aldrich C7902 2mM
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761 26mM
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021 10mM
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A-0278 2.0mM
Adenosine Sigma-Aldrich A4036 0.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT) Sigma-Aldrich H7904 100nM
Paraformaldehyde (PFA) EM Sciences 19200 4%
L-Lysine Sigma-Aldrich L-6027 0.1M
Sodium Metaperiodate Sigma-Aldrich S-1878 0.01M
Rabbit anti NG2 antibody Chemicon (Millipore) AB5320 1:500
Mouse anti CC1 antibody Calbiochem (Millipore) OP80 1:200
Mouse anti Ki67 antibody Vision Biosystems NCL-Ki67-MM1 1:300
Mouse anti NeuN antibody Chemicon (Millipore) MAB377 1:500
Species specific secondary antibodies Jackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS) 5%
Triton X-100 0.10%
Mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size Fisher Scientific PICM03050
Bottle top filters Fisher Scientific 09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope

Referências

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Citar este artigo
Hill, R. A., Medved, J., Patel, K. D., Nishiyama, A. Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination. J. Vis. Exp. (90), e51835, doi:10.3791/51835 (2014).

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