תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination
Summary
A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.
Abstract
תאי NG2 להביע (polydendrocytes, תאי מבשר oligodendrocyte) הם אוכלוסיית תאי גלייה הגדולה הרביעית במערכת העצבים המרכזית. במהלך התפתחות עוברית ואחרי לידה הם פעילים להתרבות וליצור oligodendrocytes myelinating. תאים אלה בדרך כלל נחקרו בתרבויות עיקריות ניתקו, cocultures נוירון, וברקמות קבועות. קווים מהונדסים זמינים עתה באמצעות עכבר פורסים מערכות תרבות יכולות לשמש כדי לחקור התפשטות והתמיינות של תאי שושלת oligodendrocyte בשני אזורי החומר האפורים ולבנים של המוח הקדמי ובמוח קטן. תרבויות פרוסה מוכנות מעכברים לאחר לידה מוקדמות ונשמרות בתרבות לתקופה של עד חודש 1. ניתן הדמיה פרוסות אלה מספר רב של פעמים על פני תקופת התרבות לחקור את התנהגות ואינטראקציות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הדמיה של חלוקת תא NG2 ואת המדרגות מובילות לבידול oligodendrocyte תוך שהוא מאפשר ניתוח מפורט של אזור-תלויהתא ent NG2 והטרוגניות פונקציונלית oligodendrocyte. זוהי טכניקה רבת עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור את האותות הפנימיים וחיצוניים המשפיעים על תאים אלה לאורך הזמן בסביבה סלולרית שדומה מאוד שמצאו in vivo.
Introduction
תרבויות פרוסה Organoytpic של מערכת העצבים המרכזית הוכיחו להיות מאוד שימושי לחקר תא עצב וביולוגיה של תא גליה במערכת semiintact 1 – 4. תרבויות אלה הן פשוטות יחסית לאמץ ולשמור על יתרונות רבים של תרביות תאים ניתק עיקריות כגון מניפולציה של הסביבה תאית וגישה קלה להדמית תא חי לטווח ארוך חוזר ונשנה וקלטות אלקטרו 5 – 9. בנוסף, תרבויות פרוסה לשמור cytoarchitecture רקמה 3 ממדים, קישוריות עצבית אזורית, ואת רוב סוגי תאים קיימים במערכת. תכונות אלו הופכות את תרבויות אלה מערכת ייחודית ונוחה לחקור בודדת התנהגות תא ופיזיולוגיה עם אינטראקציות הסלולר וסביבתיות.
תאי NG2 הם אוכלוסייה של תאי גליה במערכת העצבים המרכזית של היונקים שממשיכות להתרבות וליצור מ 'yelinating oligodendrocytes במהלך עוברי ולאחר לידה פיתוח 10. הם נחקרו רבים בתרביות תאים ראשוניים ניתק, והפיתוח האחרון של קווי עכבר מהונדסים עם ביטוי תא ספציפי NG2 של חלבוני ניאון יש להקל במיפוי גורל vivo וקלטות אלקטרו בהכנות פרוסה חריפות. גם בלימודים אלה, מעט מאוד ידוע על הדינמיקה הזמנית של התפשטות תאי NG2 ובידול oligodendrocyte. למרות שתרבית תאים ניתקים היא בשימוש נרחב למתקן היחסי במניפולציות תרופתית וגנטיות, זה לא מתאים לחקירת הבדלים פונקציונליים של תאים אלה באזורי מוח שונים ובמיוחד כאשר הוא רצוי לשמור על ההקשר של microenvironment הסלולרי. תרבויות פרוסה לספק אלטרנטיבה פשוטה שניתנים למניפולציות תרופתיים והיה בשימוש כדי לחקור myelination oligodendrocyte 11,12, תאתגובת ular לאחר lysolecithin (LPC) או נוגדן מושרה פגיעה במיאלין 13,14, ואינדוקציה של חידוש יצירת המיאלין באמצעות טיפול תרופתי 15.
שיטה לחקור ולבצע הדמיה חיה ורקמות קבועות (או postfixation) ניתוח של התפשטות NG2 והתמיינות של תאי oligodendrocyte בתרבויות פרוסה organotypic נלקחו משני המוח הקדמי ובמוח הקטן מתוארת. זוהי שיטה רבת עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור את גורל התא של תאי NG2 אחד לאחר חלוקת 16 ולגלות הבדלי region- ותלוי גיל בהתפשטות תאי NG2 המושרה גורם גדילה 17. טכניקה פשוטה יחסית זו היא נגישה לציבור רחב כדי לחקור תא נוסף פנימי ו / או סביבתי מנגנונים המסדירים את הפיסיולוגיה של תאי גליה אלה ותגובתם לפעילות עצבית או נזק המיאלין.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myelination במערכת העצבים המרכזית הוא חיוני לתקשורת עצבית יעילה והישרדות axonal 22. תאי NG2 ברציפות ליצור oligodendrocytes myelinating לבגרות תוך שמירה על אוכלוסיית תושב באזורים במוח ביותר 16,23 – 25. כמה מנגנונים גנטיים ומולקולריים המסדירים את ההתמיינות של תאים אלו תוארו אבל הרבה ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.
Materials
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope |
Referências
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -. J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neurociência. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
