Органотипической срез культуры для изучения олигодендроцит Динамика и миелинизации
Summary
A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.
Abstract
NG2 экспрессирующие клетки (polydendrocytes, клетки-предшественники олигодендроцитов) являются четвертым главным населения глиальных клеток в центральной нервной системе. Во время эмбрионального и постнатального развития они активно размножаются и генерировать myelinating олигодендроцитов. Эти клетки обычно были изучены в первичных диссоциированных культур нейронов, совместных культурах, и в основной ткани. Использовании новейших трансгенных линий мышей нарезать системы культивирования могут быть использованы для исследования пролиферацию и дифференцировку олигодендроцитов клона клеток в обоих серого и белого вещества регионах переднего мозга и мозжечка. Срез культуры готовят из ранних послеродовых мышей и хранятся в культуре в течение до 1 месяца. Эти кусочки могут быть отображены несколько раз в течение периода культивирования исследовать клеточный поведение и взаимодействие. Этот метод позволяет визуализация разделения NG2 клеток и шаги, ведущие к олигодендроцитов дифференциации при одновременном обеспечении подробный анализ региона-зависитЛОР NG2 клеток и олигодендроцитов функциональная гетерогенность. Это мощный метод, который может быть использован, чтобы исследовать внутренние и внешние сигналы, влияющие на эти клетки в течение долгого времени в сотовой среде, которая близко напоминает, что найдено в естественных условиях.
Introduction
Organoytpic срез культуры центральной нервной системы, оказались чрезвычайно полезны для изучения нейрон и глиальных клеточной биологии в semiintact системы 1 – 4. Эти культуры сравнительно просто принять и сохранить множество преимуществ первичных культурах диссоциированных клеток, таких как манипуляции с внеклеточной среде и легким доступом для повторил долгосрочного изображений живых клеток и электрофизиологических записей 5 – 9. Кроме того, срез культуры поддерживать 3-мерное тканей цитоархитектуры, региональных связей нейронной, и большинство крупных типы клеток присутствуют в системе. Эти свойства делают эти культуры уникальную и удобную систему для расследования одного поведение клеток и физиологию с сотовой и экологических взаимодействий.
NG2 клетки население глиальных клеток в центральной нервной системе млекопитающих, которые продолжают пролиферировать и генерируют мyelinating олигодендроцитов во время эмбрионального и постнатального развития 10. Они были широко изучены в диссоциированных первичных клеточных культур, и недавняя разработка трансгенных линий мышей с клеточно-специфической экспрессии NG2 флуоресцентных белков способствовала в отображении естественных судьбы и электрофизиологических записей в острых срезов препаратов. Даже с этими исследованиями, мало известно о временной динамики пролиферации клеток NG2 и олигодендроцитов дифференциации. Хотя диссоциированной клеточной культуры широко используется для относительного объекта в фармакологических и генетических манипуляций, он не подходит для допроса функциональные различия этих клеток в разных отделах головного мозга, особенно, когда желательно, чтобы поддерживать контекст сотовой микросреды. Срез культуры обеспечивают простой альтернативой то, что поддается фармакологических манипуляций и были использованы для расследования олигодендроцитов миелинизации 11,12, клеткаулар ответ после лизолецитина (LPC) или антитела индуцированной демиелинизации 13,14 и индукцию ремиелинизации через фармакологического лечения 15.
Способ для расследования и выступать с концертами изображений и фиксированной ткани (или postfixation) анализ пролиферации клеток NG2 и олигодендроцитов дифференциации в органотипических культур срез, взятых из обоих переднего мозга и мозжечка, описанное. Это мощный метод, который может быть использован для изучения клеток судьбу отдельных клеток NG2 после деления 16 и открыть для себя Region- и зависит от возраста различия в фактор роста распространения индуцированных NG2 клеток 17. Этот сравнительно простой метод широко доступны для дальнейшего расследования ячейку внутренней и / или окружающей среды механизмы, регулирующие физиологию этих глиальных клеток и их реакцию на нейронной активности или повреждения миелина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Миелинизация в центральной нервной системе имеет важное значение для эффективного нейронов и аксонов связи выживание 22. NG2 клетки непрерывно генерировать myelinating олигодендроцитов во взрослую жизнь, поддерживая постоянное население в большинстве областей мозга 16,23 – 25. Неко?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.
Materials
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope |
Referências
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -. J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neurociência. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
