Analyse av Tubular Membran Networks i hjertemuskelceller fra Atria og ventriklene

Hos friske tverrstripet muskelceller, rørformede membranstrukturer med "tverrgående" orienteringer (T-tubuli) vinkelrett på de viktigste celle aksen er rikelig. Følgelig har T-tubuli blitt karakterisert som kontinuerlig forlengelse av muskelcelle hoved "lateral" overflatemembran (sarcolemma), som penetrerer dypt i cytosol til cellen senteret. Den fysiologiske rollen til T-tubuli sammenhengende med den ytre overflate membranen er den raske elektrisk kopling av fjern intracellulære rom som er dannet av kontaktorganelle SER domener gjennom den relativt store hjertemuskelcellevolum av nanometrisk nærhet kobling av spenningsaktiverte L-type Ca2 ⁺ kanaler (Cav1.2) innover strøm (I _Ca) aktivering tilstøtende ryanodine reseptor (RyR2) SER Ca ^{2 +} utgivelser. I ventrikulære myocytes (VMS), de ikke-kontinuerlige kontakter membran ("veikryss") mellom junctional SER domener og T-tubules er tenkt å kontrollere tusenvis av individuelle intracellulære Ca ^{2 +} utgivelsen nanodomains i hver celle ^en.

For enhver kontakt domene, de sidestilt membran porsjoner hver av T-tubule og det perifere (junctional) SER er ca 15 nm i nærheten av hverandre, dermed definert som nanodomain. Dermed er veldig små individuelle cytoplasmatiske underrom segregert som gjør kvasi celle-autonom compartment atferd. Når et innkommende aksjonspotensial aktiverer Cav1.2 kanaler i T-tubuli av VMs, en relativt liten Ca ^{2 +} innover strøm vil raskt øke underrom Ca ^{2 +} konsentrasjon [Ca ^{2 +]} _S i attoliter størrelse nanodomain ^en. Neste, [Ca ^{2 +]} _S økning aktiverer Ca ^{2 +} -gated ryanodine reseptorer (RyR2) innenfor nanometer nærhet i sidestilt SER membran krysset, og denne koplingen prosessen skjer gjennom all elektrisk pard myocyte nanodomains. RyR2s skje så tett flerkanals klynger med en estimert støkiometri av en Cav1.2 kanal for 5-10 RyR2 kanaler ^2. Siden SER-til-cytosol [Ca2 ^+] er meget bratt gradient (forhold 10 ^4: 1) og RyR2s fungere som høy-konduktans Ca2 ⁺ frigivelse kanaler i funksjonelt koblede klynger, RyR2 aktivering resulterer i en kvantitativt stort Ca ^{2 +} frigjøre strøm fra T-tubulære kombinert junctional SER domener økende lokal underrom [Ca ^{2 +]} _S til 100 mikrometer eller høyere innen 1-2 msek ^3,4. Denne hjerte signalamplifikasjon atferd er også referert til som Ca ^{2 +} indusert Ca ^{2 +} utgivelsen (CICR). Til sammen T-tubuli er essensielle membranstrukturer som raskt aktivere Ca ^{2 +} utgivelsen signaler gjennom junctional nanodomain SER kontakter og celle-wide CICR ​​under eksitasjon-kontraksjon (EF) kobling.

I tillegg til T-tubuli, aksial tubulis (a-tubuli) med en vesentlig annen retning parallelt med de viktigste (langsgående) celle aksen har blitt dokumentert ved elektronmikroskopi (EM), konfokal og 2-foton mikroskopi studier. For eksempel ble en celle-wide kontinuerlig gitter av A-tubuli mellom myofibrils koblet sammen med T-tubuli nærheten sarkomerlengda Z-linjer vist av ekstracellulære sporstoffer og EM avbildning av fast marsvin VMs ^fem. Ved hjelp av ekstracellulære dekstran bundet fluorescein flekker og leve to-foton avbildning av rotte VMs, ble en kompleks retikulære 3D tubule nettverk visualisert som består av ~ 60% T-tubuli og ~ 40% A-tubuli ^seks. Denne studien ikke bare ført til 3D-visualisering av rikelig A-tubuli, men også til den erkjennelse at seksjonering for EM visualisering nødvendigvis reduseres for analyse av komplekse og dynamiske membran nettverk som tverr-axial tubulære system (TATS). Følgelig konfokal levende celle avbildning av TATS membraner direkte farget med di-8-ANNEPS ble utviklet. Dersom levende celleTATS nettverk er analysert av Fourier transformasjon, er den vanlige utseendet på T-tubuli komponenter i plass i nærheten sarkomerlengda Z-linjer reflekteres av ensemblet strøm spekteret fra en region av tverrstripet signaler ^7. Denne indirekte analyse strategien har blitt brukt til å oppdage celledekkende regionale endringer i TATS komponent regularitet i sykdomsmodeller ^7. For eksempel, shRNA mediert junctophilin-2 knock-down forårsaket hjertesvikt og isoformen spesifikke proteinmangel førte til T-tubuli omorganisering med nanodomain Ca ^{2 +} utgivelsen dysfunksjon ^åtte. Vi har nylig utvidet analyse av TATS membran nettverk gjennom direkte kvantitative tilnærminger og videre av levende celle superresolution mikroskopi av individuelle TATS komponenter i mus VMs bruker stimulert emisjon mangel (STED) nanoscopy ^ni. Nanometrisk bildeoppløsning tillates for direkte analyse av mindre individuelle TATS komponenter, som omtrentlig 50:50 fordeling av tverrversus aksiale tubulære orientering, kvantitativt bekrefter to rikelig ennå ulikt orienterte individuelle TATS komponenter hos friske mus hjerter ^ni. Disse strategiene vil bli nærmere beskrevet i protokollen nedenfor.

Mens fysiologiske rollen til de rike A-tubulære komponenter i den voksne hjertet har vært gåtefulle, har EM studier dokumentert SER membran strukturer knyttet til A-tubuli tyder endogen Ca ^{2 +} utgivelsen nanodomains i marsvin og rotter VMs ^5,10. Konfokal analyse av Cav1.2 og RyR2 funnet en høy grad av colocalization på A-tubulære veikryss ^10. Siden ~ 20% av spontane Ca ^{2 +} gnister i rotte VMs oppsto relativt langt borte fra Z-linje striper der T-tubuli vanligvis oppstår, har ett argument vært at A-tubule forbundet nanodomains kan faktisk eksistere og fungere som Ca ^{2 +} utgivelsen sider ^11,12. Interessant, T-tubule dannelse og modning occurs bare etter fødselen og paralleller veksten av hjerteceller, f.eks gjennom spirende av forløper sarcolemmal invaginations på P5 og umoden forgrenet TATS nettverks forsamlinger på P10 i mus ^13. Det ser ut til at Junctophilin-2 er spesielt viktig for postnatal TATS nettverk modning siden shRNA knock-down hindret forankring av T-tubulære membraner til SER veikryss som fører til forsinket Ca ^{2 +} utgivelsen og patologisk TATS organisasjon i samsvar med umoden A-tubule dominerte arkitekturer i VMs ^13. Disse observasjonene kan til slutt føre til proof-of-concept som T-tubuli danne gjennom membranen invagination prosesser mens en-tubuli kan morph gjennom ytterligere eller alternative intracellulære mekanismer ^14.

Karakterisering av TATS membran endringer i hjertesykdommer har blitt et viktig forskningsområde for patofysiologiske spørsmål. Første rapportene i en hund modell av pacing-indusert hjerte failure viste et underskudd på T-tubuli og Cav1.2 strøm (I _Ca) ^15. En gris modell av iskemisk kardiomyopati viste redusert T-tubuli tettheter og en redusert synkronisering av intracellulær Ca ^{2 +} løslate ^16. Ved hjelp av en spontant hypertensive rotter (SHR) modell av hjertesvikt, ble et tap på T-tubuli assosiert med redusert nanodomain kobling av Cav1.2 og RyR2 av den foreslåtte mekanisme "RyR2 orphaning" ^7. Et tap av T-tubuli har også vist seg i menneskelig VMs fra iskemiske, utvidede, og hypertrofiske kardiomyopati prøver ^17. Videre ble en økning i A-tubuli rapportert i vevssnitt av menneskelig dilatert kardiomyopati ^18. Etter hjerteinfarkt, viste vi en differensial mekanisme TATS omorganisering i mus VM med betydelig reduksjon av T-tubuli i motsetning til økning av A-tubulære komponenter ^ni. Viktigere, forbedret lokal membran kontrast oppnås gjennom levende celle superredetaljert kvantitativ komponent analyse løsning STED mikros aktivert gjennom direkte målinger som viste betydelig spredning av A-tubuli med generelle økningen av TATS nettverk lengde og forgrening kompleksitet ^ni. Videre ble det vist at trening kan reversere T-tubule ombygging hos rotter etter hjerteinfarkt ¹⁹ og at hjerte resynkroniseringsbehandling kan føre til reversere ombygging av T-tubuli i hunder med atrial tachypacing indusert hjertesvikt ^20. Til sammen vil studier både i syke mennesker og dyr VMs så vel som potensielle terapeutiske intervensjoner uten tvil dra nytte av høy kvalitet celleisolasjonsprosedyrer og detaljerte kvantitative analysestrategier som skissert i protokollen og resultater seksjoner nedenfor.

Videre, som demonstrert nylig av sideflate versus TATS membran omsetning av KATP kanal isoformene ^21, er det viktig å vurdere atrial myocytes (AMS) som biologisk distinkt samt komparativ hjertecellemodell versus VMs. T-tubuli ble nylig dokumentert i sau og menneskelig AMs ^22. Undersøkelser viser at få T-tubuli eksistere i AM celler og vanligvis i større pattedyr som sau og mennesker, men ikke i små gnagere ^23. I motsetning til VMs, i AMS intracellulær Ca ^{2 +} utgivelsen ser ut til å oppstå fra celleoverflaten forplanter ved diffusjon mot celle senter som resulterer i merket romlig og tidsmessig Ca ^{2 +} bakker ^23. Innenfor denne rammen synes det er viktig å belyse mekanismer for intracellulær Ca ^{2 +} signale ustabilitet for vanlige sykdomsformer som atrieflimmer ^24. I sammendrag, er begge AM og VM celleisolasjon og hver for friske og syke hjerter som vanligvis blir anvendt protokoller. Bare hvis celle isolasjon er gjort riktig bedømt ved mikroskopisk dokumentasjon av tilstrekkelig celle kvalitet, bør AM og VM-prøvene være carried frem for kvantitativ TATS analyse. Følgelig følgende protokoll delene er kritisk avhengig av høy kvalitet celle isolater fra mus eller andre arter etterfulgt av levende celle mikroskopi for å analysere intakte TATS membraner. Som påpekt tidligere, er karakterisering av TATS membraner en utfordrende forskningsområde med en tilbøyelighet for fiksering og forberedelse gjenstander ^6, endringer membran på grunn av osmotiske endringer og oppløsning begrensninger konvensjonell lysmikroskopi ^ni. Vi merker at de siste state-of-the-art protokoller for isolering av menneske AMs for Ca ^{2 +} bildebehandling og patch-clamp og av rotte VMs for cellekultur, har tidligere blitt publisert i dette tidsskriftet ^25,26.

MERK: Alle dyr prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University Medical Center Göttingen i samsvar med human omsorg og bruk av forsøksdyr.

1. Isolering av Atriale og ventrikulær muskelceller fra mus Hjerte

1. Håndtere dyr så skånsomt som mulig og i henhold til godkjente protokoller for å minimere stress i generelt og spesielt for å unngå potensielle kraftige utilsiktede effekter fra neurohormonal utskeielser på isolerte hjerteceller. I tillegg injisere hver mus med heparin (500 IE / kg kroppsvekt sc) minst 20 min før hjertet utvinning for å hindre blodpropp og micro emboli som i betydelig grad kan kompromittere yield og integritet av hjerteceller under isolasjon.
2. Anesthetize mus i alderen 12 uker eller eldre ved isofluran innånding, bekrefte fravær av smerte abstinens reflekser, og avlive dyr ved halshugging.
   1. Pakk hjertet raskt følge tidligere etablert ekspert protokoller (se for eksempel Kaestner et al. ²⁶ og Louch et al. ^27). Unngå utilsiktet skade på atriene ved unødvendig klemming eller stretching.
   2. Bevare vev av den proksimale stigende aorta forsiktig ved hjelp av et par av stubbe tang og rette saks for å etablere en kontinuerlig tverrgående skjærekant via aorta karveggen, noe som er viktig for vellykket kanylering og perfusjon av hjertet.
3. Overfør det utskårende hjerte umiddelbart inn i iskald nominelt Ca ^{2 +} fri perfusjon buffer (for løsninger se tabell 1). Hold de store fartøyene klemt under overføring gjennom luft inn buffer for å unngå utilsiktet luftemboli inntil hjertet er helt nedsenket. Bruk BDM i bufferen og isavkjølt løsninger for å hemme hjertets sammentrekning.
4. Bruk en kikkert zoom mikroskop med tilstrekkelig 3D Illumination.
   1. Cannulate aorta henhold panoramaStereo av hjertet med en glatt, polert overflate 21 G kanylen (ytre diameter 0,81 mm, for normale mus hjertevekt) som må være fullstendig fylt med buffer. Pass på at det ikke er luftbobler i kanylen ved å koble en proksimale løsning reservoar (f.eks en sprøyte) gjennom en to-veis Luer ventil slik at for rask løsning flytkontroll.
   2. Bekreft henhold kikkert forstørrelse at kanylen er riktig plassert inne i aorta, som er ca 1 mm over aorta ventiler og koronar grener. Absolutt unngå noen passasje gjennom eller utilsiktet perforasjon av aorta ventiler med kanylen (dette vil permanent forstyrre aortaklaffen nedleggelse og dermed forstyrre hjerte perfusjon).
5. Knyt aorta forsiktig til skreddersydde, perifert orientert anti-skli spor nær slutten av kanylen ved hjelp av to silke sting. Spyl ikke koronar arteries hardt på noe punkt. Koble løsningen fylt kanyle knyttet til aorta og hjertet til en tettsittende strøm kontakten på en tilpasset og pre-kalibrert perfusjon system, aka den modifiserte Langendorff oppsett (enten ved hjelp av konstant trykk eller konstant flyt, se også omtale nedenfor).
6. Perfuse hjertet så snart som mulig etter 4 min ved bruk av oksygenert perfusjon buffer ved 37 ° C (mål perfusjon hastighet: 4 ml / min). Start fordøyelsen ved å bytte perfusjon til kollagenase som inneholder fordøyelsen buffer (600 U / ml kollagenase type II) i 8-10 minutter ved 37 ° C. Overvåke fremdriften av vev fordøyelsen ved å bekrefte lignende vevsforandringer inkludert økende opaqueness, mykhet, og avslappet tilstand gjennom den tilsynelatende hjerte overflaten.
7. Dissekere hjertekamrene som trengs følgende fordøyelsen. Plasser cannulated hjertet under en kikkert mikroskop og visualisere den bakre hjerteveggen. Dissekere rest ikke-hjertevev f.eks lunge ennd skipsdelene for å unngå celle forurensning i fordøyelsen buffer ved hjelp av mikro saks (for eksempel våren saks med 8 mm rett kniver) som vist i Figur 1.
8. Følg en sjekkliste som bestemte kamre, regioner og / eller celler av kollagenase fordøyd hjertet skal avvirkes (figur 1): venstre og / eller høyre atrium, fri venstre og / eller høyre hjertekammervegg, og / eller ventrikulær septum.
   1. For disseksjon av spesifikke kardiale vev, bruker en relativt bred og flat disseksjon bad belegges med et flere mm tykt lag av silikon elastomer plast. Fest apex av hjertet med en fin insekt stålpinne til bunnen elastomer laget.
   2. Avlede høyre atrial vedheng og dissekere høyre atrium like over atrioventrikulærklaffer. Fortsett disseksjon med venstre atrium. Dissekere og kast fiberventilutstyr. Til slutt, dissekere venstre og høyre gratis ventrikulære vegger og septum og / eller liteneh vev deler etter behov.
   3. Merknad kun for traineer: å få praksis, start med ikke-nedbrutte muse hjerter. For enkel anatomisk orientering, praksis vevet håndtering inkludert alle påfølgende disseksjon trinnene under binokulært syn som vist i Figur 1. Når 3D anatomi, manuell håndtering i henhold binokulært syn, og disseksjon trinnene er tilstrekkelig kjent, fortsetter du med kollagenaseklassene fordøyd muse hjerter som som er beskrevet ovenfor.
9. For ventrikkel myocyte (VM) celle isolasjon: overføre ventrikkel vevet inn 2,5 ml friskt fordøyelsen buffer. Dersom samtidig celle isoleringer fra flere organdeler, for eksempel, atriene og ventriklene forsøkes, kan en annen person til å overta den ene delen av celledissosieringsmedium prosedyre, både for å minimere og optimalisere bruken av mus ved koordinert håndtering av flere kardiale vev. Fortsett med trinn 1.9.1-1.9.4, deretter 1,10.
   1. Dissekere enten hele ventrikkel veveller bestemte deler derav (f.eks, LV, RV, frie vegg, og / eller septum) i ca 1 mm ³ stykker i 2,5 ml buffer fordøyelse ved hjelp av skarp saks (f.eks fjær sakser med 8 mm rett blad) i en 60 mm petriskål .
   2. Forsiktig distansere VMs inn cellesuspensjon ved langsom utgnidning av vevet stykker med en overføring pipette. Unngå luft bobling i celle suspensjon.
   3. Tilsett 8 ml stoppbuffer til VM cellesuspensjon og overføre cellesuspensjonen i et 15 ml konisk rør. La de gjenværende vev brikkene til å bosette seg på bunnen i ca 15 sek, men kort nok for isolerte celler til å forbli i suspensjon. Deretter høster VM suspensjon via overføring av supernatanten volum til et nytt 15 ml tube. Hvis overdreven vev stykker er tilstede, alternativt bruke en minimal 200 mikrometer i avstand nylonmesh for å separere vev-stykker fra cellesuspensjonen.
   4. La VM cellesuspensjonen sette seg på bunnen av en 15 ml coniske tube av tyngdekraften i 8 min.
   5. Vask trinn: fjern supernatanten og resuspen-deres forsiktig gjenværende VM pelleten i 10 ml buffer perfusjon. Gjenta vasketrinn 1.9.5 (valgfritt: legge til flere vasketrinn å gradvis øke Ca ^{2 +} konsentrasjon etter behov).
   6. Resuspender pelleten avgjort VM i 10 ml buffer og perfusjon fordele den gjenværende cellesuspensjon volum på 1,5 ml mikrosentrifugerør (ca. 50.000 celler per rør VM).
10. For atrial myocyte (AM) celle isolasjon: overføre fordøyd / dissekert atrial vevet inn en ml friskt fordøyelsen buffer.
    1. Skjær delvis fordøyd atrial vevet inn ca 1 mm ^tre stykker i en ml fordøyelsen buffer ved hjelp av mikro saks i en liten petriskål (f.eks 60 mm diameter). Forsiktig distansere AM celler ut av fordøyd vev stykker i celle suspensjonen med trituration med en 1 ml plast pipette med et kutt tips for å unngå skadelige væskesprut. Undertrituration strengt unngå luft bobling i celle suspensjon. Etter mekanisk agitasjon, tilsett 4 ml stopp buffer (50 mM CaCl _2, 10% BCS) å arrestere eventuelle gjenværende kollagenaseaktivitet i cellesuspensjon.
    2. Overfør AM cellesuspensjonen i et 15 ml konisk rør. Tillat de gjenværende vev stykker sedimentere ved bunnen i omtrent 15 sekunder, men kort nok for de isolerte celler til å forbli i suspensjon. Høste supernatanten volum inneholdende de frie AM celler via løsning overføring til et nytt 15 ml tube.
    3. Sentrifuger AM cellesuspensjonen, f.eks 2 min ved 20 xg ved RT eller - å foretrekke for studier membran - la cellene bosette seg sakte av tyngdekraften for 20 min i en 15 ml konisk tube.
    4. Vask trinn: kast supernatant og resuspen-deres forsiktig AM pelleten i 5 ml buffer perfusjon. Gjenta 1.10.4.
    5. Resuspender AM celler forsiktig i 5 ml perfusjon buffer. Fordel cellesuspensjon volumet i 1,5 ml mikrosentrifuge karetes (ca. 1000 AM celler per tube).
11. Analysere og dokumentere den isolerte cellepopulasjon kvalitet for hvert hjerte inkludert cellen avkastning ved hjelp trypanblått farging.
    1. Til dette fortynnes 500 pl av cellesuspensjonen som 1: 1 vol / vol med trypanblått-oppløsning (sluttkonsentrasjon 0,02%) under anvendelse av 1 ml snitt pipettespissene. Bland cellene og trypanblått forsiktig med veldig sakte opp / ned pipettering. Umiddelbart anvende trypanblått-inneholdende cellesuspensjon i et Neubauer-type forbedret cytometer og telle de intakte myocytter ved hjelp av et invertert mikroskop.
    2. Ekskludere noen celler med synlige skader, membran blebs, forstyrret striper, kontrakturer, og celler samler intracellulær trypanblått (figur 2). Også utelukke spontant kontrahering celler, som er utsatt for påfølgende celledød. For å vurdere greven av intakte celler i suspensjon, bare bruke hjertemuskelceller med jevne striper som utelukker trypanblått helecellevolum.
12. Dommer integriteten av individuelle atriale og ventrikulære myocytter ved gjennomfallende lys mikroskopi. Lagre den lyse feltet image som en TIF-fil for dokumentasjon og videre analyse.
    1. Bruk følgende kriterier for analyse av hjertecelleintegritet:
       1. bekrefte tilstedeværelse av regulære striper i hele det synlige cellevolum;
       2. bekrefte den kontinuerlige integritet sideflate membran på begge cellesidene parallelt med myofilaments;
       3. visual skarpe riller i de interkalerte plater på begge celle sider som reflekterer integriteten av spesifikke overflatemembranstrukturer; og
       4. visualisere fluorescerende signaler om TATS membraner (eller immunolabeled caveolin-3 protein eller andre markører membran) som beskrevet i § 3 for lokalisering korrelasjon ved siden av den underliggende cellespesifikke lyse feltet image morfologi (f.eks kombinere både bilder med ImageJ som overlegg sammensatte image).
       5. Bestem sarkomerlengde fra lyse feltet bilder. For middel sarkomerlengde, måle avstand på sekvensielt justert sarkomerlengda striper og dele avstanden med antall sarcomeres. Mål på minst to steder per celle. Utføre analysen med kommersiell programvare eller offline med ImageJ.
          MERK: Hvis behandlet med Utkoblings agenter, intakt avslappet VMs fra mus hjerte viser en gjennomsnittlig sarkomerlengde på ~ 1,9 mikrometer ^28.
13. Kvantifisere morfologi og dimensjoner av de enkelte atriale og ventrikulære myocytter fra det utsendte lys-mikroskopi bilde. Tenk at AM og VM-celler varierer betydelig i størrelse. Mål celle lengde, bredde og areal, og beregne lengden: bredde-forhold.
    1. Analysere 2D celle dimensjoner fra den overførte lys bilde i ImageJ bruke kommandoer polygon valgverktøyet og legge til ROI manager, analogt til figur 3. Hvis morfologisk cDet forventes hanges innenfor spesifikke studie sammenhenger, ytterligere dokument for alle celler den spesifikke mus belastning, alder, kjønn, hjertestørrelse, og eventuelle tiltak for påfølgende dataklassifisering.

2. Farging av TATS membraner i stue atrial og ventrikulær myocytes

1. Laste bildekammeret (f.eks, POC-R2) med en 42 mm glass dekkglass. For stabil myocyte feste til dekkglass, klar 20 pl av laminin løsning ved 1:10 fortynning av laminin lager i fysiologisk perfusjon buffer (sluttkonsentrasjon 0,2 mg / ml). Spre 20 mL av laminin løsning jevnt på glass dekkglass.
2. Forbered 800 pl av en 50 mM di-8-ANEPPS løsning i perfusjon buffer. For dette, fortynne 20 pl 2 mM di-8-ANEPPS lagerløsning i 780 pl fysiologisk buffer.
3. For å flekke VM, la cellene opp ved gravitasjon i 8 min i en 1,5 ml reaksjonsrøret. Å farge AMs, enten bruke tyngdekraften sedimentering eller spi cellesuspensjonen i 2 min (se 1.10.3). For både AMs og VMS, fjern supernatanten forsiktig samtidig unngå unødvendig omrøring av cellepelleten og forsiktig cellepelleten suspenderes i 800 mL av di-8-ANEPPS holdige løsning (50 uM). Umiddelbart overføre di-8-ANEPPS / myocyte suspensjon på laminin-belagt dekkglass i bildekammeret.
4. Flekk VM suspensjonen i 15 min ved RT i mørket.
5. Sakte fjerne overflødig volum via de oppadgående fluid menisken på sidene av avbildnings kammer med en manuell pipette. Bekreft at flertallet av di-8-ANEPPS farget myocytes fortsatt godt festet til laminin-belagt dekkglass og ikke bli eksponert for luft. Deretter vaske den vedlagte myocyte mikstur en gang ved å sakte legge en ml perfusjon buffer etterfulgt ved å fjerne overflødig væske inkludert ikke-heftende celler.
6. Nøye overlappe de fargede og overflate festet myocytter med 1 ml av perfusjon buffer langsomt fra siden av than bildebehandling kammeret. Plasser bilde kammer på objektbord.

3. Imaging av TATS membran struktur i stue Atriale og ventrikulær myocytes

1. Generelt, velge den best mulige fluorescerende mikroskop alternativ (er) tilgjengelig for TATS membran bildebehandling nøye. For confocal bildebehandling, vurdere siste generasjon, moderne fluorescensmikroskoper med optimaliserte PMT array-detektorer og resirkulering foton trasé som maksimerer fluorescerende signal intensitet. For confocal avbildning av mindre detaljer om TATS membranstrukturer bruke et objektiv 63X 1.4 NA olje eller - avhengig av tilgjengelighet - bruk en STED superresolution mikroskop for minste TATS detaljer som anmeldt for myocyte spesifikke søknader fra Kohl et al ^{34 for} generelle prinsipper for høy. oppløsning fluorescens mikroskopi, kan du se i diskusjonskapittelet.
2. Sett imaging parametere for å gjenkjenne de fleste, ideelt sett alle di-8-ANEPPS farget intracellulær membraner inne i en gitt myocyte bildeplanet. Bruk følgende parametere som utgangspunkt for konfokal laser-skanning mikroskopi: eksitasjon 458 nm f.eks, ved 3% av den maksimale lasereffekten; detektere det utsendte signal mellom 550 nm og 740 nm; detektor gevinst (f.eks, master kommando 800); og pinhole 1 AU for en optisk skive tykkelse på 900 nm. Justere disse parametrene for å optimalisere signal-til-støy.
3. Bruk lyse feltet modus for å velge en intakt AM eller VM celle etter behov (Tall 4A og 4B). Se punkt 1.12 for relevante kriterier hvordan man skal bedømme celle integritet til å velge celler som oppsummert: celle-wide vanlige striper og lik sarcomere mellomrom, skarpe flatekanter og furer på alle fire celle sider, kontinuerlig integritet lateral overflaten membran, og fravær av noen membran blebs.
4. Ta et eksempelbilde av en sentral intracellulær myocyte delen. For å justere ROI bruke "crop" funksjon →; Justere beskjæringsvinduet → den endelige pikselstørrelse måler 100 nm x 100 nm. Juster x-aksen av avlingen vinduet for å korrespondere med de store (aksial / lengde) aksen av myocyte.
5. Velg det endelige bildeplanet. Bruk enkle bilderammer å velge riktig bildeplanet manuelt i z-retning. Bekreft at TATS membraner, inkludert T-tubule og A-tubuli komponenter, er visuelt tydelig i fokusplanet. Legg merke til at en typisk intracellulær avbildningsplanet kan omfatte en kjerne som intracellulære referansepunkt. Det vises til eksemplene i figurene 4A og 4B.
   MERK: Generelt holde celle eksponering for laserlys så kort som mulig. Hvis mulig, bruk enkle bilderammer for å bestemme den optimale fokusplanet i hjertemuskelceller.
6. Juster pixel holdetid til ca 0,5 usekunder. Velg 16x snitt og lagre bildet som snapshot. Gjenta bilde snapshot trinn for å etablere det aktuelle avbildningsplanet ens skissert for TATS membranstrukturer i 3.5 etter behov.
7. Lagre det endelige bildet og bekrefter at filen ble lagret i sin målmappe. Generelt, lagre alle bildefiler i samme format (f.eks LSM) for ensartet anvendelse av analyse programvare. Før eventuell bildeanalyse, nok en gang bekrefte tilstrekkelig celle integritet off-line (vurdere kriterier oppført under trinn 1.12.1) og inkluderer eventuelle skadede celler fra analyse. Se eksemplene i figur 4C og 4D.

4. Analyse av TATS Membrane Network og dets komponenter

Følgende bildebehandlings trinn for direkte analyse av TATS membran, er som top-down arbeidsflyt diagram i figur 5A og 5B.

1. Åpne bildefilen av et di-8-ANEPPS farget myocyte i Fiji (http://fiji.sc/), en fritt tilgjengelig variant av ImageJ som inneholder analyse plugins essensielle forbildebehandling. For ytterligere informasjon henvises til Schindelin et al ^29.
2. Lagre bildet → Fil → Lagre som → TIF.
3. Å analysere TATS membran komponenter, velger du riktig ROI unntatt den ytre overflaten membran signal, deretter bruke "polygon utvalg" verktøy for å avgrense ROI grensen utenom den ytre overflaten membran (sarcolemma) og inkludert intracellulære deler av TATS membraner som vist i Figur 5A (ROI). Legg den valgte ROI til "ROI Manager" ved å bruke Analyze → Verktøy → ROI Manager.
   1. For å velge en bestemt ROI for orienteringen analyse av TATS komponenter, justere hovedlengde celle aksen og bildet x-aksen parallelt. Hvis cellen er litt buet, velger flere Rois og justere hver ROI individuelt. Ekskludere noen kjerner fra analysen. Ekskludere noen overdrevent buede celler fra analysen fordi presis justering av ROIS vil bli stadig vanskeligere og øke orientering feil under analysen.
4. Slett ethvert uønsket signal informasjon fra den ytre overflate membran: Edit → Clear Utenfor å generere "valgt ROI" (figur 5A). Kontroller at det valgte ROI inneholder kun de intracellulære membran deler, som korresponderer med TATS nettverk.
5. Utfør følgende kjede av bildebehandlings trinn (kommandoer) før den påfølgende kvantitativ analyse som dokumentert i figur 5A.
   1. Klikk på → Process → Trekk Bakgrunn. Still Rolling ball radius til 5 piksler.
      MERK: Sett rullende ball radius til 5 piksler hvis bildet som skal analyseres har en pikselstørrelse på 100 nm x 100 nm. For andre bildepunktstørrelser angi rullende ball radius til antall piksler som omtrent svarer til en fysisk område på 500 nm.
   2. Klikk på → Process → Forbedre Local Contrast (CLAHE). Sett blokkstørrelsen til 49, histogram binger til 256, den maksimale helling til 3 og masken til "ingen".
   3. Klikk på → Process → Smooth.
   4. Klikk på → Plugins → Segmentering → Statistiske Region sammenslåing. Still inn parameterne til Q100 → klikk på Vis Gjennomsnitts.
   5. Bekrefte fullstendig behandling av den statistiske regionen sammenslåing angitt med automatisk presentasjon av en ny bilderammen og bekrefter at etiketten "SRM Q = 100" vises. Fortsett følgende trinn med denne bildefilen. Klikk på → Bilde → Skriv → 8-bit.
   6. Klikk på → Bilde → Juster → Threshold. Velg terskelen tilstrekkelig lav til å gjenkjenne de fleste, ideelt sett alle TATS strukturer, spesielt unngå utelukkelse av TATS komponenter med lav signalintensitet (bruk en terskel på 40 som utgangspunkt). Konsultere "Representative Resultater" for detaljert datautgang og eksemplene i Figur 6(Øvre terskel på 255). Dokumentere det endelige valget av terskel parametere. Vær oppmerksom på at riktig valg av terskel skal produsere bare bestemte TATS membranstrukturer, men ikke falske positive signaler på grunn av bakgrunnsstøy.
   7. Bekrefte riktig superimposition tats bildedetaljer versus hentet skjelett data, særlig for mellomlagring og høy fluorescens signal nivåer som skulle passe på (displayet) kontinuitet i skjelettet struktur. Når en passende terskel er blitt identifisert, anvende den samme terskel for alle bildene under analyse og gjenta sammenligning av det opprinnelige signalet overlegg versus skjelett data for å minimalisere denne gående potensiell kilde for skjevhet.
   8. Klikk på → Apply: bildedataene blir binær som vist i figur 5 under "Threshold".
   9. Klikk på → Plugins → Skeleton → Skeletonize (2D / 3D). Lagre skeletonized 2D-bilde (som vist i figur 5) som tif-fil vedklikke på → Fil → Lagre som → TIF. Analyser skeletonized bildefil for kvantitative data utgang ved å klikke på → Plugins → Analyser Skeleton (2D / 3D). Velg Prune syklus metode: ingen. Bekreft automatisk generering av den resulterende datatabellen.
   10. Lagre automatisk genererte data bordet som txt-fil. Velg de relevante kvantitative parametre f.eks, det totale antall avdelings poeng eller gjennomsnittet gren lengde som vist av eksemplarisk data i Figur 7. Vurdere videre dataanalyse med utfyllende / støtter programvareverktøy som Excel og som passer.
6. Vurdere å bruke automatiserte bildebehandlingsrutiner når det er mulig, inkludert alle nødvendige skritt som beskrevet under 4,5 for å harmonisere analyse mellom enkeltbilder og / eller bilde batcher. Bruke eksempelet tilleggskode Fil som inneholder et bildebehandlings Macro programmert for Fiji (justere programmering som nødvendig).
7. Analyser ikelte orienteringer av alle eller utvalgte TATS nettverkskomponenter fra skeletonized bildedata ved Fiji plugin "Directionality". Generere et retnings histogram der den respektive aksialt orienterte A-tubule eller tvers orienterte T-tubuli komponenter er representert ved 0 ° eller 90 ° binger. Legg merke til den korrekte referansebilderetningen, og at det er viktig for x-aksen i bildet for å samsvarer nært med de viktigste (langsgående) 0 ° akse VM cellen som vist i figur 8 og Representative resultater.
   1. Klikk på → Analyser → Directionality → spesifisere Metode: Fourier-komponenter, Nbins 180, Histogram starte -45 → klikk på skjerm bordet.
   2. Redd nygenererte og vises resultattabellen inkludert tilknyttede histogramdata som txt-fil. Vurdere videre analyse av txt fil data av gratis programvare verktøy som Excel og etter behov.
8. For å generere subklasser avdata som gruppert datasett f.eks, for alle celler behandlet under samme tilstand (og potensielt andre forhold), gjenta analysen trinn 04.01 til 04.07 for alle relevante bilder som passer. Importere skeletonized data parametere fra alle bildene i ett kombinert Excel-fil for å utlede gjennomsnittsverdier. I tillegg importere alle retningshistogramdata fra samme gruppert datasettet inn i en kombinert Excel-fil til å beregne og generere den gjennomsnittlige retningen histogram. Vurdere videre behandling av grupperte datasett å analysere flere TATS nettverksparametre av interesse for enkelte eller mellom ulike behandlingsgrupper etter behov.

I tillegg til TATS membran nettverksanalyse en rekke vanlig brukte cellebiologiske teknikker som intracellulær Ca ^{2 +} bildebehandling, patch-clamp elektrofysiologi, eller farmakologiske dose-respons studier er kritisk avhengige av høy kvalitet primære celle isolasjon fra atriene eller ventriklene eller velg deler av hjertevevet for å muliggjøre karakterisering av modne differensierte, strukturelt og fysiologisk intakt hjertemuskelceller. Derfor isolasjon og kvalitetsvurdering for AM og VM-celler som er beskrevet i § 1 er slutt nyttig for mange ulike spørsmål, inkludert den her beskrevet TATS nettverksanalyse, som avhenger kritisk over intakt membran og celle integritet.

Figur 1 gir en trinnvis manuell av bilder hvordan å gå videre med hjertevevet disseksjon starter med atrial kamre i mus hjerte. Deretter blir de ventrikulære kamre og septum fremstilt end dissekert etter behov. Presis valg og utarbeidelse av de riktige vev deler er viktig å pålitelig etablere AM og VM-isoleringer med tilstrekkelig celle renhet. Etter collagenase fordøyelsen kan det være relativt vanskelig å identifisere den korrekte linje av disseksjon mellom atrial og ventrikulær vev, er ennå en gang AM og VM-cellene blir blandet i ukontrollert cellesuspensjonen, er det umulig å reversere blandet cellepopulasjon. Derfor anatomisk orientering, 3D vev visualisering, tilstrekkelig erfaring med fordøyd vev håndtering, korrekt identifisering av spesifikke vev deler og deres disseksjon linjer vil alle bidra til suksess for cellen isolasjon.

Figur 1.Dissection av atrial vev. (A) Vender fremre delen av hjertet, to kirurgiske sutures fikse den proksimale aorta i stampe slutten av en 21 G stål kanyle. (B) Utsikt mot hjertet basis viser gjenværende lungevev hindrer atrial kammer visningen under disseksjon. LA, venstre atrium; RA, høyre atrium. (C) Gjenværende lungtissue og store blodkar ble fjernet for å få tilgang til de atrial kamre. Fylt svart trekant, lungearterien; tverrstripet trekant, lungevener; fylt hvit trekant, øvre vena cava; eske trekant, nedre vena cava. (D) For det første er den høyre atrial veggen dissekert mens tangen holder den atriale vedheng. (E) Se inn i høyre atrial kammerhulrom. Den svarte trekanten markerer intakt interatrial septum. (F) Disseksjonen fortsetter å gå inn i venstre atrium kammerhulrommet. (G) Etter fullstendig disseksjon av venstre og høyre forkammer, de atrioventrikulærklaffer blir synlige. Det fibrøse ventilapparat dissekeres og kastes for å subsequently høste bare ventrikkel muskelvev. (H) Bakre visning av de isolerte venstre og høyre forkammer. LA, venstre atrium; RA, høyre atrium.Scale barer: 700 mikrometer.

For å vurdere kvaliteten på celle isoleringer, Figur 2 gir typiske celle eksempler under vurdering av avkastning og levedyktighet av typisk stang eller murstein formet tverrstripet intakte myocytes, både for AMs og VMs. Litt skadet, visuelt iøynefallende samt alvorlig skadede celler med unormale overdrevent buede morfologi, eller unormale sfærisk formede celler, kan lett identifiseres inkludert trypanblått utelukkelse som beskrevet i avsnitt 1.11. Mens intakte myocytes forblir lyse og homogent tverrstripet når de utsettes for ekstracellulære trypanblått, skadede celler vanligvis vise flere membran blebs og / eller raskt samle trypanblått intracellulært indikerer membranskade. Imidlertid kan trypanblått i seg selv skade cellene gjennom unnecessarily lang inkubasjonstid og umiddelbar celle kvalitetsvurdering er derfor obligatorisk. Eksempler på mer åpenbare former for celleskader som myofilament kontraktur eller grov skade overflaten kompromittere celle integritet er vist i figur 4C og 4D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Trypan blå eksklusjon cellefarging. Isolert (A) AM og (B) VM-celler blandes i suspensjonen med trypanblått, og visualisert ved en invertert lysmikroskop vist ved 40Xmagnification. Merk thatabnormal sfæriske celler i (A) og (B) tar opp trypanblått, som indicatesmembrane leakage og strukturelle skader. I kontrast til centralAM og VM-celler med intakte membraner inkluderer trypan blått som vist. Videre oppmerksom på at intakt AM og VM-celler viser sarkomerlengda striper i hele sin celle volum, nomembrane blebs og skarpe kanter på begge laterale sidene og begge mellomlag plater. Skala barer: 20 mikrometer.

Etter vellykkede isolasjon, celleutbytter av VMs fra 5 x ¹⁰ mai til 10 juni kan forventes fra et enkelt muse hjerte fordøyelsen. Utbyttet av AMS signifikant lavere i størrelsesorden 3 x ^{3-3 oktober} x 10 ⁴ stavformet, trypanblått-ekskluderende celler. I motsetning til VM, AM isoleringer tidvis mislykkes selv i erfarne hender. Trinn 1.11 oppsummerer prosedyrer hvordan å anslå avkastningen av isolerte friske celler i suspensjon. I tillegg bestemmer den gjennomsnittlige celledimensjonene gjennom trinnet 1.13, som vist i figur 3 for individuelle AM eller VM celle isolater eller å sammenligne AM versus VM cellepopulasjoner side-by-side (etter behov). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3.Bright feltet morfometrisk analyse av hjertemuskelceller. VM kontur ble oppdaget av bilde analyseverktøy som beskrevet under trinn 1.13. Bruk polygonverktøyet til å visuelt merke og definere celle ekstracellulære grensen definert av den ytre overflaten membran for analyse. Ad den valgte regionen av interesse (ROI) til ROI leder etterfulgt av 1D avstandsmålinger. For sammenlignende studier av AM g VM dimensjoner, er det nyttig å dokumentere celle lengde, bredde og areal, og til å beregne den lengde: bredde-forhold.

Figur 4.Live membran farging av intakt atrial og ventrikulær myocytter. Tilsvarende overført lys og confocal bilder av levende di-8-ANEPPS farget intakt (A) AM og (B) VM celler. I motsetning til dette er en delvis kontrahert og potensielt skade AM med et sarkomerlengde på 1,2 mikrometer vist i (C). Innleide myocytes vanligvis viser unormalt forkortet og forvrengte TATS strukturer, derfor ekskludert fra videre analyse. En annen viktig indikator for cellemembrandefekter er membran blebs (røde trekanter), som vist i en VM i (D). Membran blebs representerer skadet overflatemembranstrukturer og celler med blebs bør utelukkes fra videre TATS analyse. Videre viser VM brutto skade tilsynelatende mangler en hel del av den nedre venstre del (merket med stjerne). I sammendrag, ved å sammenfallende lys og konfokale bilder celler morfologi og overflate intactness er dokumentert og kombinert med fluorescerende signalinformasjon. 'N' merkene nuclei utelatt fra analysen av TATS membran flekken. Gule linjer indikerer forstørret ROIs fra samme confocal bildet som presenteres ovenfor. Skala barer:. 10 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Konfokale bilder av TATS membraner med et tilstrekkelig signal-til-støy-forhold som er vist i figurene 4A og 4B er akseptert for videre kvantitativ analyse. Den TATS membran Analysen er basert på skeletonized data avledet fra de fluorescerende rettlinjede signalkomponenter. Figur 5 viser flytskjemaet for de individuelle bildeprosesseringstrinn som er beskrevet i detalj i trinn 4.3 til 4.5. Disse trinnene produsere skeletonized bilder som representerer rettlinjet TATS membran nettverk som vist for hver isolert VM (figur 5A) og AM celler (Fifigur 5B).

Figur 5.Workflow for skeletonization av fluorescerende TATS bilder. Bildebehandlings skritt som fører til en skeletonized bilde av TATS nettverk er representert av private steg-for-steg bilde eksempler både for en di-8-ANEPPS farget VM (A) og AM (B). For enkelte bildebehandlingstrinn, se § 4. Legg merke til forskjeller i skala barer:. 20μm (A) og 10 uM (B) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Et kritisk punkt under bildebehandlingen, bestemme passende terskel for data binarization som beskrevet i kapittel 4.5.6.. Det resulterende binære bildet bør inneholde bare sanne membran signaler fra TATS nettet, men ikke falske konstruksjoner som oppebæres av feilterskel fra bakgrunnsstøy-signal. Likevel er det viktig at terskelen er lav nok til å detektere alle sanne TATS konstruksjoner slik at sanne TATS komponentene ikke er feilaktig går tapt ved bildeanalyse. Figur 6 illustrerer hvordan prosessen for å velge terskelverdien under data binarization. Mens en terskel 40, som vist i figurene 6B og 6C synes hensiktsmessig å detektere alle sanne TATS konstruksjoner hver for seg, å velge en høyere terskel for eksempel 60 som vist i figur 6A ikke oppdager svakere aksial membranstrukturer (ATS) som angitt av gule trekanter . I kontrast til å velge en lavere terskel for eksempel 20 som vist i figur 6D fører til feilaktig detektering av bakgrunnsstøy som falske positive TATS strukturer som indikert avgule trekanter.

Figur 6.How å bestemme signal terskel under skeletonizing tats bildedata. Eksemplene viser TATS skjeletter hver generert for ulike terskler under data binarization (beskrevet i trinn 4.5). Øvre bilder: vise justeringene terskel bruker Fiji. Lavere bilder: overlegg av skeletonized bilder med tilhørende inngangs fluorescens bilde og forstørret regioner som angitt. En høy terskel for eksempel 60 anvendt i (A) er tydeligvis ikke egnet for å detektere alle sanne TATS strukturer som indikert av gule triangler i den forstørrede delen. En terskel på 40 anvendt i (B) og (C) detekterer alle TATS strukturer og korrekt gjenkjenner ikke bakgrunnsstøy, mens en lav terskel f.eks., 20 i (D) feilaktig identifiserer bakgrunnsstøy som TATS strukturer, og derved produserer falske positive signaler med ikke-eksisterende membranstrukturer. Falske positive signaler er indikert med gule trekanter i det forstørrede innfelt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den "Analyze Skeleton (2D / 3D)" plugin støtter detaljert analyse av skeletonized TATS strukturer. Når henrettet, plugin produserer en datatabell med følgende skjelett parametere: #branches, #junctions, # endepunkts voxel, gjennomsnittlig gren lengde, #triple poeng, #quadruple poeng, og maksimal gren lengde. For en detaljert beskrivelse av alle mulige utgang parametere påhttp: //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton og relaterte artikler ^29-31. En typisk datatabell utgang er vist i figur 7A.

Selv om hjertemuskelceller har blitt isolert og studert i flere tiår ^32, en fersk gjennomgang konkluderte med at konsistent høy kvalitet myocyte celle isoleringer forbli utfordrende ^27. Dette gjenspeiler relativt komplekse protokoller for isolering av primære hjertemuskelceller vis-à-vis en mangel på felles standard tilnærminger, felles metadata, og gjennomsiktig celle kvalitetsdokumentasjon. Celleisolasjons protokoller er vanligvis tilpasset av enkeltgrupper, produsere variable utfall av cellekulturene avhenge av individuelle modellinnstillingene (f.eks art, alder, samtidige hjertesykdommer), og er vanligvis justert for spesielle eksperimentelle forhold. Innenfor rammen av den kvantitative TATS membran studier og protokoller som presenteres her, en viktig nivå for kvalitetsvurdering og dokumentasjon gjelder confocal eller superresolution mikroskopi av individuelle cellemembranstrukturer utsatt for metabolske og isolasjon protokollavhengige endringer, bådei AM eller VM. Viktigere, selv om høy avkastning av celle isolater foreslå sunne intakte myocytes etterforskerne trenger for å dokumentere og kritisk vurdere hver enkelt celle nøye mot morfologiske kriterier av underlag og TATS membran integritet versus ikke-spesifikk skade som følge av isolasjonsprosedyrer versus konkrete endringer på grunn av ulike typer av inngrep sammenlignet med kontrollforhold. En viktig variabel ved kardial celle isolasjon er den spesifikke aktivitet for en gitt masse kollagenase. For å velge et nytt parti med kollagenase, bør den enzymatiske aktiviteten til flere kollagenaseklassene prøver testes mot hverandre ved å evaluere hjerte myocyte avling og kvalitet, og i henhold til produsentens instruksjoner. Ideelt sett er en ny masse kollagenase identifisert med kollagenaseaktivitet lik tidligere med hell brukt masse (for utvidet vurdering av mulige enzymaktivitet referere til "collagenase mye selection tool" i materialer og metoder tabell). TAken sammen, kvantitative tilnærminger TATS membran visualisering er kritisk avhengige celle isolasjon kvalitet, og vice versa, hjertecelle isoleringer fører til uspesifikke membranskade som dokumentert av TATS mikros bør utløse kritisk gjennomgang og korreksjon av isolasjonsprosedyrer. Siden celle isolasjon kvalitet og TATS membran visualisering og kvantifisering er egentlig knyttet, protokollene omtalt i denne artikkelen dekker alle viktige aspekter som en kontinuerlig strategi.

En ekstra utfordring og vanlig problem av hjerte studier, celleskader og / eller celle tap oppstå på grunn av metabolsk kompromitterende intervensjoner f.eks, etter hjerteinfarkt ^9, men trenger å bli dømt mot potensielle utilsiktet skade f.eks, etter ubemerket luftemboli under celle isolasjon. Isolering av hjertemuskelceller fra syke hjerter kan føre til ytterligere, betydelig celle tap og redusert celleutbytte. Derfor ComparIson av det totale antall isolerte intakte celler mellom kontroll og syke hjerter kan være meningsfylt hvis celle isolasjon og telling er benyttet konsekvent gjennom standardiserte protokoller. Følgelig er det viktig å vurdere celleintegritet gjennom en passende kontrollgruppe, noe som gjenspeiler den best mulige myocyte celleisolasjon kvalitet. Viktigere, enkelt celle kvalitet og levende celle mikroskopi av sunn versus syke versus myocytes utilsiktet skadet av isolasjonsmetoden kan ha stor innflytelse på analysen av TATS membran nettverk. Protokollene som presenteres her derfor understreke integritet og stabilitet av fysiologiske komponenter membran under celle isolasjon og levende celle mikroskopi av intakte membraner. Hele arbeidsflyten er utformet som en sammenhengende strategi for å oppnå og bevare intakte komponenter TATS membran mens unntatt skadede celler, siden disse vil stille isolasjon avhengige membran gjenstander som forstyrret membran tubuli, membrane blebs og endrede TATS nettverk feilaktig under kontroll forhold og kompromiss videre kvantitativ analyse. Vice versa, de samme strategiene er avgjørende for intervensjonsstudier med potensial for å forstyrre TATS membraner, som er kritisk avhengige av meningsfylte sammenligning kontrollen mellom ekte sunt versus ekte syk celle med TATS membran endringer.

I tillegg adresserer vi prosedyrer for å oppnå den teknisk mer utfordrende isolering av AM celler. Til tross for fremgang og bedre protokoller, er det viktig å understreke at det ikke er trivielt å reprodusere høykvalitets celle isoleringer av VMs og enda mindre pålitelig for AMS. Dette er på grunn av den generelt lavere utbytte av AM celler der selv små feil og variasjoner i løpet av celleisolasjon kan føre til fullstendig svikt i AM celleisolasjon, mens en mild grad av VM celleskade kan være mindre tydelig i cellesuspensjonen på grunn av relativt høy celle tall sammenlignet med AM. Siden AM celler kan bli curved etter isolasjon, kan analyse gjennom flere ROIs være en fordel som skissert i henhold til trinn 4.3. Etter en detaljert prosedyre for celle isolasjon trinn, gir vi en protokoll for direkte integrert membranfarging og confocal eller STED superresolution avbildning av TATS nettverk både for VMs og AMS. Disse protokollene at både kvantitativ analyse og differensiering av utvalgte komponenter i TATS membraner gjennom tidligere etablerte parametre. I forhold til VM, 3D-organisasjon og funksjonelle atferd av atrial TATS nettverk i AMS er for tiden mindre forstått.

Prosedyrene til bilde TATS membraner i levende celler (trinn 3.1 til 3.7) ble utviklet med kommersiell confocal (Table of Materials / utstyr) og skreddersydde STED fluorescensmikroskoper ^ni. Å optimalisere mikroskop innstillingene for fluorescerende image generasjon og kvantitativ TATS analyse, følgende punkter er av generell betydning:

• Mål For å løse små detaljer tats membranstrukturer, empirisk teste hvilke objektiv gir høyest bildekvalitet mens fokus flere mikrometer dypt i cellen. Visse konfokale mikroskop kan gi bedre resultater med vann eller glyserol mål, i motsetning til 63X 1,4 NA olje-objektiv som brukes her. Mål med 100X forstørrelse brukes til superresolution STED mikroskopi, trading av et mindre synsfelt for nanometrisk oppløsning ^34.
• Eksitasjon og Gain
  De optimale innstillingene for magnetiseringseffekt og detektor gevinst avhenger av mikroskop lysbanen, laserytelse, og prøve egenskaper. Ideelt sett er laser makt og vinning justeres for å utnytte hele spekteret av detektoren, men unngå bilde metning. Kommersielle mikrosprogramvarepakker gir vanligvis oppslagstabeller som visualiserer den nedre og øvre grense for dynamisk omfang. Videre, for å redusere fargestoffbleking anvende den lavest mulige lAser kraft som fortsatt gir tilstrekkelig strukturell TATS membran detaljer. I tillegg bør magnetiseringseffekt være lav nok til å unngå kumulativ fotoskade som fører til myocyte kontrakturer og død.
• Pixel Size
  Bruk en pikselstørrelse kompatibel med Nyquist sampling, omtrent halvparten av oppløsningen oppnås med de gitte innstillinger. For konfokal avbildning en pikselstørrelse på 100 nm x 100 nm er kompatibelt, som vil også begrense bleking. For superresolution mikros betydelig mindre pikselstørrelser brukes f.eks 20 nm x 20 nm for STED mikros ^ni.
• Dwell Time
  Konfokale mikroskoper gi en gjennomsnittsfunksjon. Generelt bruke kortest mulig pixel holdetid for å unngå bleking i kombinasjon med signal snitt f.eks linje-snitt ≥ 8 for å forbedre signal-til-støy-forholdet.
• Dokumentere Applied Mikros innstillingene via Meta-data
  Når innstillingene hvordan dubildedetaljer tats membranstrukturer ble optimalisert på en bestemt konfokalmikroskop, safe og / eller dokumentere innstillingene (protokoll meta-data). Kjøpe alle bilder i en (eller mellom) gruppe (r) av celler med samme objektiv, magnetiseringseffekt, gain, pikselstørrelse, piksel holdetid, og i snitt funksjon. Like avbildningsbetingelser gir mulighet for direkte sammenligning og kvantifisering i en (eller mellom) gruppe (r) av celler.
• For generell veiledning og ytterligere detaljer om prinsipper og anvendelser av Konfokalmikroskopi refererer til Handbook of Biological Konfokalmikroskopi (Pawley JB, ^3. utgave, 2006, Springer Science + Business Media, LLC).

I motsetning til de direkte analyse strategier som presenteres her, tidligere publikasjoner som beskriver TATS membraner og sykdomsrelaterte endringer, har brukt regionale aggregerte avlesninger av T-tubule tetthet som kvantitativ strategi ^16,17, eller indirekte regionale strategier basert på Fourier transformasjon analyse av tverrstripet membran signaler for å vurdere T-tubule komponent regularitet ^7. I kontrast er de kvantitative tilnærminger beskrevet her direkte knyttet til enkelt TATS komponenter og gi en rekke andre parametere inkludert membran nettverksegenskaper og spesifikke komponenter som prosentandelen av A-tubuli. Videre kan nettverks TATS tetthet kvantifiseres som den normaliserte lengde av hele ekstrahert skjelettet per ROI området. Antallet trippel knutepunkter i tre individuelle, kan kontinuerlig koblet tubulære komponenter benyttes som et mål for den forgrenede kompleksitet TATS membrannettverk. Vi merker oss at enhver analyse av minste TATS komponenter avhenger farvningsprosedyrer. Etter vår erfaring, 800 ul av en 50 mM di-8-ANEPPS løsningen er tilstrekkelig til å sette flekker på komp TATS nettverk i en celle-pellet inneholdende 50 000 VM celler ^9. Imidlertid, hvis cellepelleten inneholder et lavere antall hjertemuskelceller, Hvis kraftige fluorescens-detektorer er tilgjengelige, og hvis konfokal avbildning av den samlede TATS nettverket fordeling snarere enn minste membran detaljer og kvantitative forandringer er av interesse, lavere fargestoffkonsentrasjoner kan brukes basert på empirisk testing. Endelig kan en programvare makro skrevet for den beskrevne analyse benyttes for å automatisere fremgangsmåten for bildebehandling for å lette analyse av større datasett, som er spesielt nyttig for sammenligning mellom forskjellige behandlingsgrupper (f.eks narkotika), celletyper (f.eks AM versus VM ), og patofysiologiske intervensjoner (f.eks humbug versus hjerteinfarkt).

For bildeanalyse av TATS nettverk, er følgende sekvens av prinsippet skritt til grunn: 1) rullende ball bakgrunn-subtraksjon (4.5.1) for å fjerne romlige variasjoner i bakgrunnen intensitet; 2) lokal kontrastforbedring (4.5.2).; 3) kantutjevning (4.5.3); 4) statistisk region sammenslåing (4.5.4); 5) som definererterskel for bilde binarization (4.5.6); og 6) beregning av skjelettet data (4.5.8). Et kritisk trinn i skeletonization av fluorescerende TATS bilder er bilde binarization vist i figur 6. Tilhørende Terskelverdier trinn til slutt definere hvilke sanne membranstrukturer er detektert til å representere den underliggende TATS komponenter versus potensielt falske strukturer identifisert ved feil fra bakgrunnsstøy. Identifikasjon av korrekt terskel for binære bildeanalyse bør samsvare med de sanne TATS membranstrukturer, som avhenger av en tilstrekkelig høy signal-til-støy (SNR) ratio hver for konfokale og superresolution mikros tilnærminger. Derfor bør etableres et tilstrekkelig bilde kvalitet først og deretter kombinert med kritisk vurdering av enkelt celle kvalitet inkludert dokumentasjon av lyse feltet bilder som skissert. Alternative muligheter for å tilpasse bilde segmentering protokollen for en gitt mikroskop datautgang og / eller physiological spørsmål inkludere bilde deconvolution og andre Terskelverdier prosedyrer som "Otsu" eller "Iso-data" tilgjengelig som ImageJ plugins. Uavhengig av den endelige segmentering prosedyren, anser vi sammenligningen mellom utvunnet og rådata etter bilde overlegg en obligatorisk kvalitetskontroll trinn. Oppsummert vil morfologisk og membran integritet individuelle isolerte myocytes, tilstrekkelig farging av intracellulære TATS membraner, parameter optimering for fluorescens bildebehandling, og overlegget utklippede skjelett data bidrar til kvaliteten på fluorescerende TATS bilder og kvantitative resultater.

Dersom større arter enn mus anvendes for celleisolasjon, kan protokollene lett tilpasses etter ønske. For de neste større arter, kan rottehjerter bli kanylert med en stump 14 G kanylen (ytre diameter 2,1 mm) og perfusert ved 8 ml / min. Betydelig eldre eller syke hjerter kan kreve enda større kanyle størrelser. I genetral, kan hjerte perfusjon bli utført enten ved konstant trykk f.eks, ved hjelp av en 1 m høy vannsøyle mellom reservoaret og aorta eller ved konstant strømning ved hjelp av en peristaltisk pumpe. For celleisolasjon fra små gnagere hjerter som mus og rotter konstant strømning kan være fordelaktig, siden kollagenase fordøyelsen vil til slutt bryte koronare resistenskarene som fører til høye priser perfusjon fra å lekke fartøys senger som skal styres til en viss grad ved konstant strømnings protokoller. I motsetning til dette er konstant trykk perfusjon fordel om kontroll av strømningshastighet og korrekt kanylering er en prioritet, som er fordelaktig for intervensjons modeller med endrede blodkarmotstand oppførsel så vel som for trening av celleisoleringsprosedyrer.

Som beskrevet ovenfor, er det tilstrekkelig cellekvalitet meget viktig for kvantitative studier av endogene membransystemer. Men under hjertet perfusjon og kollagenase fordøyelsen mange faktorer kan critically påvirke kvaliteten på celleisolasjon, som ikke bør undervurderes under protokoll optimalisering eller feilsøking ^27. Særlig bør aktiviteten av en gitt kollagenase masse bestemmes for den spesifikke vev av interesse f.eks atria eller ventriklene før utførelse av de eksperimentelle bona fide studier for å etablere isolasjon vilkår som må opprettholdes gjennom hele resten av studien. Videre vil vannkvaliteten, pH, temperatur, optimalisering og rengjøring av perfusjon oppsett minimalisere risikoen for utilsiktet skade fra forurensninger og emboli, og eventuelt ytterligere faktorer må overvåkes for å etablere optimale betingelser homeostatiske under celleisolasjon. BDM (2,3-butandion-monoxime) en reversibel hemmer av myosin ATPase kryss broer er ofte brukt under vev disseksjon og fordøyelse å opprettholde hjertemuskelavslapning, noe som øker utbyttet av celle isoleringer. Likevel etterforskere trenger to være klar over at BDM kan utøve uspesifikke fosfatase aktivitet fører til off-target effekter f.eks, hemming av Na ⁺ / Ca ^{2 +} valutastrømmer under visse forutsetninger ^33. For noen eksperimenter kan det være fordelaktig å erstatte BDM ved Blebbistatin som cardioplegic løsning, en inhibitor med en høy affinitet for myosin i mikromolare konsentrasjoner som er imidlertid giftige, og relativt kostbare og kan ha andre off-target effekter. Resting sunne cardiomyocytes bør ikke vise noen sammentrekninger i fravær av elektrisk stimulering og slike celler bør utelukkes fra videre analyse. På den annen side, kardial myocyte sammentrekning og avslapning i respons til elektrisk stimulering ved fysiologiske ekstracellulære Ca ^{2 +-konsentrasjoner} kan brukes til å etablere normal kontraktile oppførsel som et ekstra tiltak for å vurdere funksjonelle cellekvalitet og / eller unormal oppførsel i hjertesykdom sammenlignet med friske kontroll celler.

9 og AM celler ²¹ så vel som for kvantitativ analyse av mikrotubuli nett i faste hjertemuskelceller (data ikke vist). Disse og fremtidige anvendelser av protokollene kan åpne muligheter for en rekke eksperimentelle spørsmål som karakterisering av TATS membraner på ulike utviklingsstadier eller analyse av membran assosiert protein eller organelle strukturer som henvender seg TATS nettverk for å utøve sterkt lokalisert, domenespesifikk signale funksjoner i AM og VM-celler.