Analyse van buisvormig membraan Netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers

In gezonde dwarsgestreepte spiercellen, buisvormige membraan structuur met "dwars" oriëntaties (T-tubuli) loodrecht op de hoofdleiding cel as zijn overvloedig. Dientengevolge hebben T-tubuli gekenmerkt als continue uitbreidingen van de spiercel main "lateraal" oppervlak membraan (sarcolemma), die diep doordringen in de cytosol naar het celcentrum. De fysiologische rol van T-tubuli continu met het buitenoppervlak membraan snelle elektrische koppeling van externe intracellulaire compartimenten gevormd door SER organel contact domeinen gehele relatief grote hartspiercel volume nanometrische nabijheid koppeling van voltage-geactiveerde L-Ca2 ⁺ kanalen (Cav1.2) naar binnen (I _Ca) activeren van aangrenzende ryanodinereceptor (RyR2) SER Ca ^{2 +} releases. In hartspiercellen (VM's), de niet-continue membraan contacten ("knooppunten") tussen de junctionele SER domeinen en T-tubules wordt gedacht dat duizenden individuele intracellulaire Ca2 ⁺ afgifte nanodomains controle in elke cel ^1.

Voor elk contact domein, de naast elkaar geplaatste gedeelten membraan elk van de T-tubuli en perifere (junction) SER ongeveer 15 nm dicht bij elkaar, dus gedefinieerd als nanodomain. Daarbij worden zeer kleine individuele cytoplasma deelruimten gescheiden die quasi-cel-autonome compartiment gedrag mogelijk te maken. Bij een inkomende actiepotentiaal activeert Cav1.2 kanalen in de T-tubuli van VM's, een relatief kleine Ca ^{2 +} naar binnen lopende zal snel toenemen de deelruimte Ca ^{2 +-concentratie} [Ca ^{2 +]} _S in de attoliter formaat nanodomain ^1. Vervolgens wordt de [Ca ^{2 +]} _S toename activeert Ca ^{2 +} -Gated ryanodine receptoren (RyR2) binnen nanometer nabijheid in het naast elkaar SER membraan knooppunt, en deze koppeling proces gebeurt in alle elektrisch paard myocyte nanodomains. RyR2s voorkomen als dichte multikanaals clusters voor een stoïchiometrie van 1 Cav1.2 kanaal 5-10 RyR2 kanalen ^2. Aangezien de SER naar cytosol [Ca2 ^+] gradiënt zeer steil (10 verhouding ^4: 1) en RyR2s gefunctioneerd als high-geleiding Ca2 ⁺ afgifte kanalen functioneel gekoppelde clusters, RyR2 activatie resulteert in een kwantitatief grote Ca2 ⁺ los stroom van T-tubulus gekoppeld junctional SER domeinen toenemende lokale deelruimte [Ca ^{2 +]} _S tot 100 uM of hoger binnen 1-2 msec ^3,4. Dit cardiale signaal amplificatie gedrag wordt ook wel Ca2 ⁺ geïnduceerde Ca2 ⁺ afgifte (CICR). Samen genomen, de T-tubuli zijn essentieel membraan structuur die snel activeren Ca ^{2 +} vrijlating signalen via junctional nanodomain SER contacten en cel-breed CKP tijdens excitatie-contractie (EC) koppeling.

Naast T-tubuli axiaal buisjes (A-tubules) met een significant verschillende oriëntatie parallel aan de hoofd (langs) as cellen werden gedocumenteerd door elektronenmicroscopie (EM), confocale en 2-foton microscopie studies. Bijvoorbeeld, een cel gehele continue rooster van A-tubules tussen myofibrils verbonden met T-tubuli dichtbij sarcomeer Z-lijnen werd getoond door extracellulaire tracers en EM beeldvorming van vaste cavia VM ^5. Met behulp van extracellulaire-dextran gekoppeld fluoresceïneverkleuring en live 2-foton beeldvorming van rat VM's, werd een complex reticular 3D tubulus netwerk gevisualiseerd bestaande uit ~ 60% T-tubuli en ~ 40% A-buisjes ^6. Deze studie niet alleen geleid tot 3D visualisatie van overvloedige A-tubules, maar ook tot het besef dat snijden voor EM visualisatie is inherent beperkt de analyse van complexe en dynamische membraan netwerken zoals de dwarse coaxiale tubulus systeem (TATS). Bijgevolg confocale live cell imaging van TATS membranen direct gekleurd met di-8-ANNEPS werd ontwikkeld. Als levende cellenTATS netwerken worden geanalyseerd door Fourier transformatie, wordt de regelmatige verschijning van T-tubulus componenten in de ruimte in de buurt van sarcomeer Z-lijnen weerspiegeld door het ensemble vermogensspectrum van een regio van dwarsgestreepte signalen ^7. Deze indirecte analyse strategie werd gebruikt om cel-grote regionale veranderingen in TATS component regelmatigheid detecteren ziektemodellen ^7. Zo shRNA gemedieerde junctophilin-2 afbraakprijzen veroorzaakt hartfalen en de isovorm specifiek eiwit tekort resulteerde in T-tubulus reorganisatie met nanodomain Ca ^{2 +} vrijlating dysfunctie ^8. We hebben onlangs uitgebreid de analyse van TATS membraan netwerken door middel van directe kwantitatieve benaderingen en verder door levende cellen superresolutiemicroscopie van individuele TATS componenten in de muis VM's met behulp van gestimuleerde emissie uitputting (STED) nanoscopie ^9. Nanometrische beeldresolutie toegestaan ​​voor een directe analyse van kleinere individuele TATS componenten, die een 50:50 verdeling van transversale benaderingversus axiale tubulus oriëntaties, kwantitatief bevestigen twee overvloedige nog verschillend georiënteerde individuele TATS componenten in gezonde muizen harten ^9. Deze strategieën zullen verder worden beschreven in de rubriek onderstaande protocol.

Terwijl de fysiologische rol van de overvloedige A-tubulus componenten in het volwassen hart raadselachtig is gebleven, hebben EM studies SER membraan structuren geassocieerd met A-buisjes suggereert endogene Ca ^{2 +} vrijlating nanodomains in cavia en rat VMs ^5,10 gedocumenteerd. Confocale analyse van Cav1.2 en RyR2 vond een hoge colocalization op A-tubulus kruispunten ^10. Aangezien ~ 20% spontane Ca2 ⁺ vonken in rat VM ontstaan ​​relatief ver van Z-lijn strepen waarbij T-tubuli typisch voorkomen, is een argument is dat A-tubulus geassocieerde nanodomains inderdaad bestaan ​​en functioneren als Ca ^{2 +} versieplaatsen ^11,12. Interessant is dat T-tubulus vorming en rijping occurs pas na de geboorte en loopt parallel met de groei van cardiale cellen, bijvoorbeeld door het kiemen van voorloper sarcolemmale invaginations op P5 en onvolwassen vertakt TATS netwerk samenstellingen bij een P10 bij muizen ^13. Het blijkt dat Junctophilin-2 is bijzonder belangrijk voor postnatale maturatie TATS netwerk aangezien shRNA neerhalen verhinderde de verankering van T-tubuli membranen SER knooppunten leidt tot vertraagde Ca2 ⁺ afgifte en pathologische TATS organisatie overeenstemming met onrijpe A-tubulus gedomineerd architecturen VM ^13. Deze waarnemingen kunnen uiteindelijk leiden tot proof-of-concept dat T-buisjes te vormen door middel van membraan invaginatie processen, terwijl A-buisjes kan morph door aanvullende of zelfs alternatieve intracellulaire mechanismen ^14.

Karakterisering van TATS membraan veranderingen in hart-en vaatziekten is uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied voor pathofysiologische vragen. De eerste berichten in een hond model van pacing-geïnduceerde hart failure toonde een verlies van T-tubuli en Cav1.2 (I _Ca) ^15. Een varken van ischemische cardiomyopathie vertoonden verminderde T-tubulus dichtheden en een verminderd synchronie van intracellulaire Ca ^{2 +} los ^16. Met behulp van een spontaan hypertensieve rat (SHR) van hartfalen, een verlies van T-tubuli werd geassocieerd met een verminderde nanodomain koppeling van Cav1.2 en RyR2 door het voorgestelde mechanisme van "RyR2 orphaning" ^7. Een verlies van T-tubuli is ook aangetoond in humane VM ischemische, verwijde, en hypertrofische cardiomyopathie monsters ^17. Bovendien, een toename A-buisjes werd gerapporteerd in weefselcoupes van menselijke gedilateerde cardiomyopathie ^18. Na een myocardinfarct, toonden we een differentiële mechanisme van TATS reorganisatie in muis VM's met een significante afname van de T-tubuli in tegenstelling tot een toename van de A-tubulus onderdelen ^9. Belangrijker nog, verbeterde lokale membraan contrast bereikt door levende cellen superreoplossing STED microscopie ingeschakeld gedetailleerde kwantitatieve elementanalyse door directe metingen, die aanzienlijke proliferatie van de A-tubuli met de algemene toename van de TATS netlengte en vertakking complexiteit ⁹ is. Bovendien werd aangetoond dat de training mag de T-tubulus remodeling in ratten te keren na een hartinfarct ¹⁹ en dat cardiale resynchronisatietherapie kan leiden tot een herinrichting van de T-tubuli te keren bij honden met atriale tachypacing geïnduceerd hartfalen ^20. Samen genomen, zullen studies zowel in de zieke mens en dier VMs alsook mogelijke therapeutische interventies misschien wel profiteren van hoge kwaliteit celisolatie procedures en gedetailleerde kwantitatieve analyse strategieën zoals beschreven in het protocol en de resultaten hieronder secties.

Zoals onlangs aangetoond door mantelvlak versus TATS membraantransport van KATP kanaal isovormen ^21, is het belangrijk om atriale m overwegenyocytes (AMS) als biologisch te onderscheiden, alsmede vergelijkende cardiale cel model versus VM's. T-buisjes werden onlangs gedocumenteerd bij schapen en menselijke AMs ^22. Huidige gegevens wijzen erop dat enkele T-tubuli bestaan ​​in AM cellen en meestal in grotere zoogdieren als schapen en mensen, maar niet in de kleine knaagdieren ^23. In tegenstelling tot VM, in AMs intracellulaire Ca2 ⁺ afgifte blijkt plaats te vinden van het celoppervlak teeltmateriaal door diffusie naar het celcentrum waardoor aangegeven ruimtelijke en temporele Ca2 ⁺ gradiënten ^23. In dit kader lijkt het van belang om de mechanismen van intracellulaire Ca ^{2 +} signalering instabiliteit voor veel voorkomende ziekte vormen verhelderen zoals atriumfibrilleren ^24. Samengevat, zijn zowel AM VM celisolatie en elk voor gezonde en zieke harten algemeen gebruikt protocollen. Alleen als celisolatie goed uitgevoerd zoals beoordeeld door microscopische documentatie voldoende cel kwaliteit, moet AM en VM monsters ca zijnrried voorwaarts voor kwantitatieve TATS analyse. Bijgevolg is de volgende protocol secties sterk afhankelijk zijn van hoge kwaliteit mobiele isolaten van muis of andere soorten, gevolgd door live-cell microscopie intact TATS membranen te analyseren. Zoals reeds eerder op gewezen, karakterisering van TATS membranen is een uitdagend onderzoeksgebied met een neiging tot fixatie en voorbereiding artefacten ^6, membraan veranderingen als gevolg van osmotische veranderingen, en resolutie beperkingen van conventionele lichtmicroscopie ^9. We merken op dat de recente state-of-the-art-protocollen voor de isolatie van de mens AMs voor Ca ^{2 +} imaging en patch-clamp en rat VMs voor celkweek zijn eerder gepubliceerd in dit tijdschrift ^25,26.

OPMERKING: Alle dierlijke procedures werden beoordeeld en door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van het Universitair Medisch Centrum Göttingen goedgekeurd in overeenstemming met de humane zorg en het gebruik van proefdieren.

1 Isolatie van atriale en ventriculaire Myocyten van de Muis van het Hart

1. Handvat dieren zo voorzichtig mogelijk en volgens de goedgekeurde protocollen om stress te minimaliseren in het algemeen en in het bijzonder om potentiële krachtige onbedoelde effecten van neuro-hormonale excessen op geïsoleerde cardiale cellen voorkomen. Bovendien injecteren elke muis met heparine (500 IU / kg lichaamsgewicht sc) ten minste 20 min voor hart winning tot bloedstolling en micro emboli die aanzienlijk kunnen compromitteren de opbrengst en integriteit van hartcellen tijdens isolatie te voorkomen.
2. Verdoven muizen 12 weken of ouder door isofluraan inademing jaar, bevestigen afwezigheid van pijn terugtrekking reflexen, en euthanaseren dieren door cervicale dislocatie.
   1. Pak het hart snel na eerder vastgestelde deskundige protocollen (bijvoorbeeld, zie Kaestner et al. ²⁶ en Louch et al. ^27). Vermijd onbedoelde schade aan de boezems door onnodige knijpen of uit te rekken.
   2. Zorgvuldig behouden het weefsel van de proximale aorta ascendens met een paar pincetten stomp en rechte schaar om een ​​doorlopende transversale snijrand via aorta vaatwand, wat belangrijk is voor succesvolle infusen en perfusie van het hart vast.
3. Breng het uitgesneden hart onmiddellijk in ijskoude Ca2 ^+-vrije nominaal perfusiebuffer (oplossingen zie tabel 1). De grote vaten geklemd tijdens de overdracht via de lucht in de buffer te houden om onbedoelde luchtembolie te voorkomen totdat het hart volledig is ondergedompeld. Gebruik BDM in de buffer en ijsgekoelde oplossing cardiale contractie te remmen.
4. Gebruik een verrekijker zoom microscoop met voldoende 3D Illumnatie.
   1. Canule de aorta onder panoramische StereoVision van het hart met een glad, gepolijst oppervlak 21 G canule (buitendiameter 0,81 mm, voor een normale muis hart gewicht) die volledig moeten worden ingevuld met buffer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de canule door een proximale oplossing reservoir (bijvoorbeeld een injectiespuit) verbinden door middel van een 2-weg Luer klep om snelle oplossing flow control.
   2. Bevestigen onder verrekijker vergroting dat de canule correct is geplaatst in de aorta, dat is ongeveer 1 mm boven de aortaklep en coronaire takken. Absoluut te vermijden elke passage door of onbedoelde perforatie van de aortaklep met de canule (dit zal permanent aorta klep sluiting verstoren en daardoor verstoren cardiale perfusie).
5. Bind de aorta zachtjes maat omtreksrichting gerichte anti-slip groeven nabij het uiteinde van de canule met twee zijden hechtdraden. Niet spoelen van de coronaire arteries krachtig op elk punt. Sluit de oplossing gevuld canule gebonden aan de aorta en het hart van een goed sluitend uitstroom connector van een op maat gemaakte en vooraf gekalibreerd perfusiesysteem, aka de gewijzigde Langendorff setup (hetzij met behulp van constante druk of constant debiet, zie ook bespreking hieronder).
6. Perfuseren het hart zo spoedig mogelijk 4 min met zuurstof perfusie buffer bij 37 ° C (termijn perfusiesnelheid: 4 ml / min). Start de digestie door het schakelen van de perfusie met collagenase digestie buffer (600 U / ml collagenase type II) gedurende 8-10 minuten bij 37 ° C. Bewaken van de voortgang van het weefsel spijsvertering door te bevestigen soortgelijke veranderingen weefsel waaronder toenemende ondoorzichtigheid, zachtheid en slapheid in het hele zichtbare hart oppervlak.
7. Ontleden de hartkamers indien nodig na digestie. Plaats de gecannuleerd hart onder een binoculair microscoop en visualiseren de achterste hartwand. Ontleden resterende niet-hartweefsel bijvoorbeeld een longnd delen verblijf verontreiniging cel in de digestiebuffer middels micro schaar voorkomen (bijvoorbeeld spring schaar met 8 mm rechte bladen) zoals getoond in figuur 1.
8. Volg een checklist die bijzonder kamers, gebieden en / of cellen van de collagenase digestie hart worden geoogst (figuur 1): linker en / of rechter atrium, vrij linker en / of rechter ventrikel wand, en / of ventriculaire septum.
   1. Voor dissectie specifieke hartweefsel, in een relatief breed en vlak dissectie bad bekleed met een enkele mm dikke silicone elastomeer. Bevestig de apex van het hart met een fijne insect stalen pin onderaan elastomeerlaag.
   2. Afleiden rechts hartoor en ontleden het rechter atrium boven de atrioventriculaire kleppen. Ga door de dissectie met het linker atrium. Ontleden en de vezelachtige klep apparaat weggooien. Tot slot, ontleden het links en rechts vrij ventriculaire wanden en het septum en / of kleineer weefsel zonodig onderdelen.
   3. Opmerking alleen voor stagiairs: naar de praktijk te krijgen, te beginnen met de niet-verteerde muis harten. Voor het gemak van anatomische oriëntatie, oefenen de tissue handling inclusief alle opeenvolgende dissectie stappen onder binoculair zicht, zoals weergegeven in figuur 1. Zodra de 3D ​​anatomie, manueel hanteren onder de binoculair zicht, en dissectie stappen zijn voldoende vertrouwd, ga verder met de collagenase verteerde muis harten als hierboven beschreven.
9. Voor ventriculaire myocyte (VM) celisolatie: breng het ventriculaire weefsel in 2,5 ml vers spijsvertering buffer. Indien gelijktijdige cel isolaties uit verschillende organen, bijv, atria en ventrikels wordt geprobeerd kan een tweede persoon via een been van de cel dissociatie procedure nemen zowel te minimaliseren en een optimaal gebruik van muizen door gecoördineerde hanteren van meerdere hartweefsel. Ga door met stap 1.9.1-1.9.4, daarna 1.10.
   1. Ontleden ofwel de gehele ventriculaire weefselof specifieke delen daarvan (bijvoorbeeld LV, RV, vrij wanden en / of septum) in bij benadering 1 mm ³ stuks in 2,5 ml digestiebuffer met scherpe schaar (bijvoorbeeld spring schaar met 8 mm rechte bladen) in een 60 mm petrischaal .
   2. Zachtjes distantiëren VMs in celsuspensie door langzame wrijven van het weefsel stukken met een transfer pipet. Vermijd luchtbellen in celsuspensie.
   3. Voeg 8 ml stopbuffer de VM celsuspensie en breng de celsuspensie in een 15 ml conische buis. Laat het restmateriaal stukken bezinken op de bodem gedurende ongeveer 15 seconden, maar kort genoeg om geïsoleerde cellen in suspensie blijven. Vervolgens oogsten de VM schorsing via overdracht van het volume supernatant naar een nieuwe buis van 15 ml. Als er te veel weefsel stukken aanwezig zijn, gebruik als alternatief een minimaal 200 urn afstand nylon mesh om het weefsel stukken scheiden van de celsuspensie.
   4. Laat de VM celsuspensie naar de bodem van een 15 ml cosche buis door de zwaartekracht gedurende 8 minuten.
   5. Wasstap: verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de resterende VM pellet in 10 ml perfusiebuffer. Herhaal wasstap 1.9.5 (optioneel: voeg extra wasbeurt stappen om geleidelijk verhogen van de Ca ^{2 +-concentratie} als nodig).
   6. Resuspendeer de vaste VM pellet in 10 ml perfusie buffer en de resterende celsuspensie volume in 1,5 ml microcentrifugebuizen (ongeveer 50.000 VM cellen per buis) te verdelen.
10. Voor atriale myocyte (AM) celisolatie: breng het verteerd / ontleed atriale weefsel in 1 ml vers spijsvertering buffer.
    1. Snijd het gedeeltelijk verteerde atriale weefsel in ongeveer 1 mm ³ stuks in 1 ml spijsvertering buffer met behulp van micro schaar in een kleine petrischaal (bv 60 mm diameter). Zachtjes distantiëren AM cellen uit de verteerde weefsel stukjes in celsuspensie met wrijven met een 1 ml plastic pipet met een cut tip om schadelijke fluïdumstralen voorkomen. Tijdensaanwrijven strikt voorkomen dat luchtbellen in celsuspensie. Na mechanisch roeren, voeg 4 ml stop buffer (50 uM _CaCl2; 10% BCS) om alle resterende collagenase activiteit in celsuspensie arresteren.
    2. Breng de AM celsuspensie in een 15 ml conische buis. Laat het restmateriaal stukken bezinken op de bodem gedurende ongeveer 15 seconden, maar kort genoeg om de geïsoleerde cellen in suspensie blijven. Oogst volume supernatant dat de vrije AM cellen via oplossing overplaatsing naar een 15 ml buis.
    3. Centrifugeer de AM celsuspensie, bijvoorbeeld, 2 min bij 20 xg bij kamertemperatuur of - bij voorkeur voor membraan studies - laat de cellen tot rust komen langzaam door de zwaartekracht gedurende 20 minuten in een 15 ml conische buis.
    4. Wasstap: de bovenstaande vloeistof en voorzichtig resuspendeer de pellet in AM 5 ml perfusiebuffer. Herhaal 1.10.4.
    5. Hersuspenderen AM cellen zachtjes in 5 ml perfusie buffer. Verdeel de celsuspensie volume in 1,5 ml microcentrifuge tubes (ongeveer 1000 AM cellen per buis).
11. Te analyseren en documenteren van de geïsoleerde kwaliteit mobiele populatie voor elk hart, waaronder de celopbrengst behulp trypaanblauw vlekken.
    1. Hiervoor verdun 500 ui van de celsuspensie met 1: 1 vol / vol met trypan blauwe oplossing (eindconcentratie 0,02%) met 1 ml Uiterste pipetpunten. Meng de cellen en de trypan blauwe licht door zeer langzaam op / neer pipetteren. Breng onmiddellijk de trypan blauwe celsuspensie met een Neubauer type cytometer verbeterd en tel de intacte myocyten behulp van een omgekeerde microscoop.
    2. Uitsluiten alle cellen met zichtbare schade membraan blebs, onderbroken strepen, contracturen en cellen accumuleren intracellulaire trypan blauw (figuur 2). Ook uitsluiten spontaan samentrekkende cellen, die gevoelig zijn voor de daaropvolgende celdood zijn. Om de telling van intacte cellen in suspensie te beoordelen, alleen gebruiken hartspiercellen met regelmatige strepen die hele trypaanblauw sluitenhet celvolume.
12. Oordelen over de integriteit van individuele atriale en ventriculaire myocytes door doorgelaten licht microscopie. Afbeelding opslaan de heldere veld als een TIF-bestand voor de documentatie en verdere analyse.
    1. Gebruik de volgende criteria voor de analyse van cardiale celintegriteit:
       1. bevestigen de aanwezigheid van regelmatige strepen over het gehele zichtbare cel volume;
       2. bevestigen de voortdurende integriteit van het mantelvlak membraan aan beide zijden cel parallel aan de myofilamenten;
       3. visualiseren scherpe vertanding bij de ingelaste schijven aan beide zijden cel die de integriteit van de specifieke oppervlakte membraan structuur weer te geven; en
       4. visualiseren de fluorescerende signalen van TATS membranen (of immunolabeled caveolin-3-eiwit of een ander membraan markers) zoals beschreven in hoofdstuk 3 voor lokalisatie correlatie naast de onderliggende cel-specifieke helder beeldveld morfologie (bijvoorbeeld, combineer beide beelden met ImageJ als overlay verbinding IMAGe).
       5. Bepaal de sarcomeer lengte van de helderveld beelden. Voor gemiddelde sarcomeer lengte, meet de afstand van elkaar uitgelijnd sarcomeer strepen, en verdeel de afstand door het aantal sarcomeren. Meet minstens twee locaties per cel. Voer de analyse uit met commerciële software of offline met ImageJ.
          OPMERKING: Als behandeld met ontkoppeling agenten, intact ontspannen VM uit muis hart tonen een gemiddelde sarcomeer lengte van ~ 1,9 micrometer ^28.
13. Kwantificeren van de morfologie en de afmetingen van de individuele atriale en hartspiercellen van de verzonden afbeelding lichtmicroscopie. Bedenk dat AM en VM cellen aanzienlijk verschillen in grootte. Meet de cel lengte, breedte, en het gebied, en het berekenen van de lengte: breedte verhouding.
    1. Analyseer de 2D cel afmetingen van het doorgelaten licht afbeelding in ImageJ met de opdrachten polygoon selectietool en toe te voegen aan ROI manager, analoog aan Figuur 3. Indien morfologische cijzigingen worden verwacht binnen specifieke studie contexten ander document voor alle cellen de specifieke muizenstam, leeftijd, geslacht, hartgrootte en eventuele maatregelen voor daaropvolgende data classificatie.

2 Kleuring van TATS Membranen in Living atriale en ventriculaire Myocyten

1. Laad de beeldvorming kamer (bijvoorbeeld POC-R2) met een 42 mm glas dekglaasje. Voor stabiele myocyten bevestiging aan het dekglaasje bereiden 20 ul van laminine oplossing 1:10 verdunning van de laminine voorraad in fysiologische perfusie buffer (eindconcentratie 0,2 mg / ml). Spreid 20 ul van de laminine oplossing gelijkmatig over de glazen dekglaasje.
2. Bereid 800 pi van een 50 pM di-8-ANEPPS oplossing perfusiebuffer. Hiervoor Verdun 20 ui 2 mM di-8-ANEPPS voorraadoplossing in 780 gl fysiologische buffer.
3. VM's vlekken, laat de cellen af ​​te wikkelen door de zwaartekracht gedurende 8 min in een 1,5 ml reageerbuis. AMS vlek, ofwel gebruik maken van de zwaartekracht sedimentatie of spin de celsuspensie gedurende 2 min (zie 1.10.3). Voor beide amendementen en VM's, verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof, terwijl het vermijden van onnodige onrust van de cel pellet en voorzichtig resuspendeer de cel pellet in 800 ul van di-8-ANEPPS bevattende oplossing (50 uM). Onmiddellijk over te dragen van de di-8-ANEPPS / myocyt ophanging op de-laminin gecoate dekglaasje in de beeldvorming kamer.
4. Vlekken op de VM suspensie voor 15 min bij kamertemperatuur in het donker.
5. Verwijder langzaam overtollige volume via de opwaartse vloeistof meniscus aan de zijkanten van de beeldvorming kamer met een manuele pipet. Bevestigen dat de meerderheid van de di-8-ANEPPS gekleurd myocytes stevig blijft verbonden aan de-laminin gecoate dekglaasje en niet worden blootgesteld aan lucht. Vervolgens was de bijgevoegde myocyten suspensie eenmaal door langzaam toevoegen van 1 ml van perfusie buffer gevolgd door het verwijderen van overtollige vloeistof met inbegrip van niet-hechtende cellen.
6. Overlay voorzichtig bevlekt en oppervlak bevestigd myocyten met 1 ml perfusiebuffer langzaam van de kant van thij beeldvorming kamer. Plaats de beeldvorming kamer op de microscoop podium.

3 Beeldvorming van TATS Membraanstructuren in Living atriale en ventriculaire Myocyten

1. In het algemeen, kies zorgvuldig de best mogelijke fluorescentiemicroscoop optie (s) beschikbaar voor TATS membraan beeldvorming. Voor confocale beeldvorming, overweeg recente generatie, moderne fluorescentie microscopen met geoptimaliseerde PMT serie detectoren en foton recycling routes die fluorescerende intensiteit van het signaal te maximaliseren. Voor confocale beeldvorming van kleinere details van TATS membraanstructuren gebruik een objectief 63X 1,4 NA olie of - afhankelijk van de beschikbaarheid - gebruik een STED superresolutie microscoop voor kleinste TATS informatie zoals beoordeeld voor myocyt- specifieke toepassingen door Kohl et al ³⁴ Voor algemene beginselen van het hoog. resolutie fluorescentie microscopie, verwezen naar de paragraaf discussie.
2. Stel de imaging parameters op te sporen de meeste, idealiter alle di-8-ANEPPS gekleurd intracellulaire membranen in een bepaalde myocyte beeldvlak. Gebruik de volgende parameters als uitgangspunt voor confocale laser scanning microscopie: excitatie 458 nm bv bij 3% van de maximale laservermogen; detecteert het uitgezonden signaal tussen 550 nm en 740 nm; detector te krijgen (bijvoorbeeld, meester commando 800); en pinhole 1 AU voor een optische schijfje dikte van 900 nm. Pas deze parameters de signaal-ruis te optimaliseren.
3. Gebruik helderveld mode om een intacte AM of VM cel geval (figuren 4A en 4B) selecteren. Zie punt 1.12 van relevante criteria hoe celintegriteit oordelen aan cellen te selecteren als samengevat: cel-brede regelmatige strepen en gelijke sarcomeer afstand, scherpe oppervlak randen en ribbels aan alle vier zijden cel, continue integriteit van de laterale oppervlak membraan, en de afwezigheid van elk membraan blaasjes.
4. Neem een ​​monster beeld van een centrale intracellulaire myocyte sectie. Aan te passen de ROI gebruik van de "oogst" functie →, Passen het gewas venster → de uiteindelijke pixelgrootte meet 100 nm x 100 nm. Stel de x-as van het gewas venster te corresponderen met de grote (axiaal / lengte-as) van de myocyten.
5. Selecteer de uiteindelijke beeldvlak. Gebruik enkele beeldframes de juiste beeldvlak handmatig in de z-richting. Bevestigen dat de TATS membranen, waaronder T-tubulus en A-tubulus componenten, wel duidelijk zichtbaar in het brandvlak. Merk op dat een typische intracellulaire beeldvlak een kern als intracellulaire referentiepunt omvatten. Zie de voorbeelden in figuren 4A en 4B.
   Opmerking: In het algemeen houden cel blootstelling aan laserlicht zo kort mogelijk. Indien mogelijk, gebruik maken van enkele foto frames om de optimale focal plane bepalen in hartspiercellen.
6. Stel de pixel verblijftijd ongeveer 0,5 usec. Selecteer 16x middeling en neem het beeld op als momentopname. Herhaal het beeld snapshot stap naar de juiste beeldvlak een vasts geschetste TATS membraanconstructies in 3.5 als nodig.
7. Sla het uiteindelijke beeld en bevestigen dat het bestand in de doelmap werd gered. In het algemeen, slaat u alle beeldbestanden in hetzelfde formaat (bv LSM) voor een uniforme toepassing van analyse software. Voorafgaand aan een beeldanalyse, bevestigen nogmaals voldoende celintegriteit off-line (overwegen vermeld onder stap 1.12.1 criteria) en exclusief eventuele beschadigde cellen uit de analyse. Zie de voorbeelden in figuren 4C en 4D.

4 Analyse van de TATS Membraan netwerk en zijn componenten

De volgende beeldverwerking stappen voor een directe analyse van TATS membraan componenten worden samengevat als top-down workflow diagram in de figuren 5A en 5B.

1. Open het beeld van een di-8-ANEPPS gekleurd myocyt in Fiji (http://fiji.sc/), een vrij beschikbare variant van ImageJ die analyse plugins essentieel voor bevatbeeldverwerking. Voor verdere informatie verwijzen wij u naar Schindelin et al ^29.
2. Sla de afbeelding op → Bestand → Opslaan als → Tif.
3. Om de TATS membraan componenten analyseren, selecteert u de juiste ROI exclusief de buitenkant membraan signaal, gebruik dan de "polygon selection" tool om de ROI grens met uitzondering van het buitenste oppervlak membraan (sarcolemma) en met inbegrip van de intracellulaire gedeelten van TATS membranen af ​​te bakenen, zoals weergegeven in Figuur 5A (ROI). Voeg de geselecteerde ROI aan de "ROI Manager" door het toepassen van Analyze → Extra → ROI Manager.
   1. Om een ​​specifieke ROI voor de oriëntatie analyse van TATS componenten selecteren, plaatst u de belangrijkste longitudinale cel-as en de x-as parallel. Als de cel is licht gebogen, selecteer meerdere ROI's en lijn elke ROI individueel. Sluiten alle kernen van de analyse. Uitsluiten geen overmatig gebogen cellen uit de analyse, omdat nauwkeurige uitlijning van ROis zal steeds moeilijker worden en het verhogen van oriëntatie fouten tijdens de analyse.
4. Verwijder alle ongewenste signaal informatie uit het buitenste oppervlak membraan: Bewerken → Wis Buiten aan de "geselecteerde ROI" (figuur 5A) te genereren. Zorg ervoor dat het geselecteerde ROI bevat alleen de intracellulaire membraan delen, die overeenkomen met de TATS netwerk.
5. Voer de volgende keten van beeldverwerking stappen (commando's) voor de daaropvolgende kwantitatieve analyse zoals beschreven in figuur 5A.
   1. Klik op → Proces → Aftrekken Achtergrond. Stel de Rolling bal straal tot 5 pixels.
      OPMERKING: Stel de rollende bal straal tot 5 pixels als het beeld te analyseren heeft een pixelgrootte van 100 nm x 100 nm. Voor andere pixelgroottes stellen de rollende bal radius het aantal pixels die ongeveer overeenkomt met een fysieke straal van 500 nm.
   2. Klik op → Proces → Verbeter Local Contrast (ClahE). Stel de blokgrootte tot 49, het histogram bakken tot 256, de maximale helling naar 3, en het masker op "none".
   3. Klik op → Proces → Smooth.
   4. Klik op → Plugins → Segmentatie → Statistische Gewest samenvoegen. Stel de parameters voor Q100 → klik op Toon Gemiddelden.
   5. Bevestig volledige verwerking van de statistische regio fusie aangaan aangegeven met automatische presentatie van een nieuw image frame en bevestigen dat het label "SRM Q = 100" verschijnt. Ga verder met de volgende stappen met dit beeldbestand. Klik op → Beeld → Type → 8-bit.
   6. Klik op → Afbeelding → Aanpassen → Drempel. Kies de drempel laag genoeg om de meeste sporen, idealiter alle TATS structuren, vermijdt in het bijzonder de uitsluiting van TATS componenten met een lage signaal intensiteit (gebruik een drempel van 40 als uitgangspunt). Raadpleeg de "Representatieve resultaten" sectie voor gedetailleerde data-uitgang en de voorbeelden in figuur 6(Bovenste drempel van 255). Documenteer de uiteindelijke keuze van de drempel parameters. Merk op dat de juiste keuze van de drempel alleen specifieke TATS membraanstructuren vals positieve signalen als gevolg van achtergrondgeluiden mag produceren, maar niet.
   7. Bevestig correct superpositie van TATS beelddetails versus geëxtraheerd skelet gegevens, met name voor gemiddelde en hoge fluorescentie signaalniveaus, waarbij de (display) continuïteit van de skeletstructuur overeenkomen. Zodra een passende drempel is vastgesteld, gelden dezelfde drempel om alle beelden tijdens de analyse en herhaal de overlay vergelijking van het oorspronkelijke signaal versus skelet gegevens om consequent deze potentiële bron van vertekening te minimaliseren.
   8. Klik op → Apply: de beeldgegevens wordt binair zoals weergegeven in figuur 5 onder "Threshold".
   9. Klik op → Plugins → Skeleton → schets maken (2D / 3D). Sla het skelet 2D-afbeelding (zoals weergegeven in figuur 5) als TIF-bestand doorop → Bestand → Opslaan als → Tif klikken. Analyseer het skelet beeldbestand voor kwantitatieve data-uitgang door op → Plugins klikken → Analyseer Skeleton (2D / 3D). Kies Prune cyclus methode: geen. Bevestig het automatisch genereren van de resulterende gegevens tabel.
   10. Sla de automatisch gegenereerde data tabel als txt-bestand. Selecteer de gewenste kwantitatieve parameters, zoals het aantal vertakkingspunten en de gemiddelde scheutlengtes zoals blijkt uit voorbeeldgegevens in figuur 7. Bestudering van verdere gegevensanalyse met aanvullende / ondersteunende software tools zoals Excel en passend.
6. Overwegen om geautomatiseerde beeldverwerking routines gebruiken waar mogelijk met inbegrip van alle nodige stappen onder 4.5 beschreven aan de analyse tussen de afzonderlijke beelden en / of afbeelding batches te harmoniseren. Gebruik het voorbeeld Aanvullende Code bestand met een beeldverwerking Macro geprogrammeerd voor Fiji (aanpassen van de programmering als nodig).
7. Analyseer de individu oriëntaties van alle of selecteer TATS netwerkcomponenten van het skelet beeldgegevens door de Fiji-plugin "Directionality". Genereer een richtingsgevoeligheid histogram waarbij de respectievelijke axiaal georiënteerde A-buisje of dwars georiënteerd T-tubuli componenten worden vertegenwoordigd door de 0 ° of 90 ° bakken. Let op de juiste referentie van beeldoriëntatie en dat het belangrijk is voor de x-as van het beeld nauw overeen met de belangrijkste (longitudinale) 0 °-as van de VM cel zoals getoond in figuur 8 en Representatieve resultaten.
   1. Klik op → Analyseren → Directionality → opgeven Methode: Fourier componenten, Nbins 180, Histogram beginnen -45 → klik op Beeldscherm tafel.
   2. Sla de nieuw gegenereerde en weergegeven resultaten tafel inclusief bijbehorende histogram gegevens als txt-bestand. Overweeg een nadere analyse van het txt-bestand gegevens door gratis software tools zoals Excel en als dat nodig is.
8. Om subklassen van het genererengegevens als gegroepeerd datasets bijvoorbeeld voor alle cellen behandeld onder dezelfde voorwaarde (en mogelijk andere voorwaarden), herhaal dan de analyse stappen 4,1-4,7 voor alle relevante afbeeldingen waar nodig. Importeer de skeletonized data parameters van alle beelden in een gecombineerd Excel-bestand met het oog op de gemiddelde waarden af ​​te leiden. Daarnaast importeert alle gerichtheid histogram gegevens uit dezelfde gegroepeerde data tot een gecombineerd Excel-bestand te berekenen en genereren van de gemiddelde gerichtheid histogram. Overweeg verdere verwerking van gegroepeerde datasets om extra TATS netwerk parameters van belang voor individuele of tussen de verschillende behandelgroepen analyseren als dat nodig is.