Här beskriver vi en effektiv metod för isolering, identifiering och rening av mus-tymus epitelceller (TEC). Protokollet kan användas för studier av thymus-funktionen för normal T-cellsutveckling, tymusdysfunktion, och T-cells rekonstitution.
Den bräss är ett viktigt organ för T-lymfocyter utveckling. Av tymiska stromaceller, tymiska epitelceller (TEC) är särskilt viktigt på flera stadier av T-cellsutveckling: T-cell engagemang, positiv urval och negativt urval. Dock förblir funktionen av TEC i tymus ofullständigt känd. I artikeln ger vi en metod för att isolera TEC delmängder från frisk mus bräss med en kombination av mekanisk störning och enzymatisk nedbrytning. Metoden tillåter tymiska stromaceller och tymocyter som skall effektivt frigöres från cell-cell-och cell-extracellulär matrix-anslutningar och för att bilda en enkelcellsuspension. Med hjälp av isolerade celler, kan multi flödescytometri tillämpas på identifiering och karakterisering av TEC och dendritiska celler. Eftersom TEC är en sällsynt cellpopulation i tymus, även beskriver vi ett effektivt sätt att berika och rena TEC genom att tömma tymocyter, den mest förekommande celltyp i tymus. Follovinge anrikn, cellsortering tid kan minskas, så att förlust av cellviabilitet kan minimeras under rening av TEC. Renade celler är lämpliga för olika nedströms analyser som Real Time-PCR, Western blot och genuttryck profilering. Protokollet kommer att främja forskning av TEC funktion och liksom utvecklingen av in vitro-T-cell beredning.
Tidigt i T-cellsutveckling, är benmärg hematopoetiska stamcellsderiverade multi stamceller rekryteras till cortex i tymus, genomgår engagemang för T härstamning och blir T-cell prekursorer 1. I cortex, T-cell prekursor CD4 och CD8 dubbla negativa (DN) thymocyter expandera och differentiera till omogna CD4 och CD8 dubbelt positiva (DP) tymocyter, som bildar en stor pool av progenitorer med mycket variabel T-cellsreceptorer 1. Endast en utvald MHC-begränsad delmängd av DP celler blir CD4 eller CD8 enda positiva (SP) tymocyter, migrera till medulla i tymus, och differentierar till funktionellt kompetenta mogna T-celler, en händelse som kallas positiv selektion 2- 6. Däremot kloner av auto-reaktiva tymocyter genomgår negativt urval och avlägsnas via apoptos, omräknat till regulatoriska T-celler för självtolerans, eller avledas till intraepitelial lymfocyter för ändamål som är ännu oklart 3.7-10.
I bräss, tymiska stromaceller bildar en unik mikromiljö som ger signaler för dessa olika T-cell utvecklings öden 5,11,12. Thymic stromaceller är sammansatta av tymiska epitelceller (TEC) – inklusive kortikala TEC (cTECs) och medullära TEC (mTECs), dendritiska celler, makrofager, fibroblaster, endotelceller, neurallist-härledda pericyter och andra mesenkymala celler 13-15. Bland dessa, TEC är avgörande vid de olika stadierna av T-cellsutveckling 1,2,16,17. Dock har bristen på ett robust sätt att isolera TEC försvårat en omfattande förståelse för deras funktion 16. Särskilt cTECs, som bildar ett tredimensionellt nätverk kring stamceller i hjärnbarken, är avgörande för positiv selektion 13,18,19 skäl som ännu inte är klar. Tidigare studier förutsatt ledtrådar till heterogenitet och roll TEC, främst förlita sig på morfologiska och histologiska verktyg 13 </sup>. Nyligen de unika roller TEC grupper behandlades av genetiska metoder i musmodeller 12,20. En robust och reproducerbart sätt att isolera TEC är grundläggande för att uppnå opartisk karakterisering av TEC undergrupper, kvantitativ och kvalitativ bedömning av TEC funktioner och förtydligande av mekanismer hur cTECs stödja positiva val.
På grund av sällsynthet TEC i tymus och snäva interaktioner bildar i intakta organ, har isoleringen av TEC varit utmanande. Protokollet som beskrivs här bygger på tidigare upptäckter, för närvarande tillgängliga reagens, tekniker och kunskap om bräss struktur och stromal sammansättning. Nästan två decennier sedan, har flera förfaranden rapporterades att dela upp bräss vävnader 21-27, där olika enzymer användes under matsmältningen, inklusive trypsin, kollagenas och Dispase. Gray et al. jämfört dessa enzymer i sin precedure 28, och redovisade ett förbättrat methOD med flera steg nedbrytning av enzym cocktails 29 som blev ofta används 20,30. Dock innebär en lång förberedelsetid och komplexa rötningssteg och resulterar i varierande final cell nummer och proportioner av TEC även inom samma mus kohort 29,30 denna metod. För flera år sedan, Liberase forskningskvalitet enzym, innehållande högrenat kollagenas och neutrala proteas började användas i thymus vävnadsdissociering 30. Här beskriver vi en Liberase digestion-baserat protokoll, med optimerade rutiner mekanisk separation, som ger ett stort antal livskraftiga TEC från mus bräss vävnader. .
Att berika dissocierade stromaceller, har tidigare studier använt antingen densitetsgradienter eller magnetiska pärla separation 21,29. Men båda metoderna orsaka allvarlig förlust av vissa populationer av tymiska stromaceller, särskilt befolkningen i cTECs 29. Cytotoxiska eliminering och panorering tekniker <sup> 31,32 har i stor utsträckning använts för utarmning eller separation av lymfocyter i den immunologiska fältet 12,31. Efter jämförelse av dessa tekniker har vi etablerat det nuvarande panorering protokoll för anrikning av TEC. Den milda tillstånd under förfarandet anriknings leder till mindre celldöd och opartisk och ökad TEC återhämtning.
Den isolerade bräss cellsuspensionen beskrivs i avsnitt 3 kan appliceras direkt på flödescytometrisk analys för identifiering och karakterisering av TEC delmängder och dendritiska celler. Avsnitt 4 beskriver ett enkelt och användbart sätt att identifiera TEC delmängder som använder multi flödescytometer. För experiment som syftar till att erhålla renade cTECs eller mTECs, TEC anrikning och cellsortering förfaranden finns i avsnitt 5 och 6.
I protokollet, kritiska steg är att förbereda bräss stromaceller (avsnitt 3) och anrikning av TEC (avsnitt 4). Det rekommenderas starkt att färsk enzymlösning bereds varje gång och vävnaden behandlas så snart som möjligt. För poolade Thymi, är att optimera volymen av enzymlösning som krävs beroende på antalet Thymi. Om någon vävnad rester finns kvar efter behandling, kan lägga till mer enzymlösning och förlängning av inkubationstid öka cellutbytet. Under anrikning av TEC, slutföra samling av supern…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (till KAH). Vi tackar också University of Minnesota flödescytometri Resurs.
Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |