Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller
Summary
Här beskriver vi en effektiv metod för isolering, identifiering och rening av mus-tymus epitelceller (TEC). Protokollet kan användas för studier av thymus-funktionen för normal T-cellsutveckling, tymusdysfunktion, och T-cells rekonstitution.
Abstract
Den bräss är ett viktigt organ för T-lymfocyter utveckling. Av tymiska stromaceller, tymiska epitelceller (TEC) är särskilt viktigt på flera stadier av T-cellsutveckling: T-cell engagemang, positiv urval och negativt urval. Dock förblir funktionen av TEC i tymus ofullständigt känd. I artikeln ger vi en metod för att isolera TEC delmängder från frisk mus bräss med en kombination av mekanisk störning och enzymatisk nedbrytning. Metoden tillåter tymiska stromaceller och tymocyter som skall effektivt frigöres från cell-cell-och cell-extracellulär matrix-anslutningar och för att bilda en enkelcellsuspension. Med hjälp av isolerade celler, kan multi flödescytometri tillämpas på identifiering och karakterisering av TEC och dendritiska celler. Eftersom TEC är en sällsynt cellpopulation i tymus, även beskriver vi ett effektivt sätt att berika och rena TEC genom att tömma tymocyter, den mest förekommande celltyp i tymus. Follovinge anrikn, cellsortering tid kan minskas, så att förlust av cellviabilitet kan minimeras under rening av TEC. Renade celler är lämpliga för olika nedströms analyser som Real Time-PCR, Western blot och genuttryck profilering. Protokollet kommer att främja forskning av TEC funktion och liksom utvecklingen av in vitro-T-cell beredning.
Introduction
Tidigt i T-cellsutveckling, är benmärg hematopoetiska stamcellsderiverade multi stamceller rekryteras till cortex i tymus, genomgår engagemang för T härstamning och blir T-cell prekursorer 1. I cortex, T-cell prekursor CD4 och CD8 dubbla negativa (DN) thymocyter expandera och differentiera till omogna CD4 och CD8 dubbelt positiva (DP) tymocyter, som bildar en stor pool av progenitorer med mycket variabel T-cellsreceptorer 1. Endast en utvald MHC-begränsad delmängd av DP celler blir CD4 eller CD8 enda positiva (SP) tymocyter, migrera till medulla i tymus, och differentierar till funktionellt kompetenta mogna T-celler, en händelse som kallas positiv selektion 2- 6. Däremot kloner av auto-reaktiva tymocyter genomgår negativt urval och avlägsnas via apoptos, omräknat till regulatoriska T-celler för självtolerans, eller avledas till intraepitelial lymfocyter för ändamål som är ännu oklart 3.7-10.
I bräss, tymiska stromaceller bildar en unik mikromiljö som ger signaler för dessa olika T-cell utvecklings öden 5,11,12. Thymic stromaceller är sammansatta av tymiska epitelceller (TEC) – inklusive kortikala TEC (cTECs) och medullära TEC (mTECs), dendritiska celler, makrofager, fibroblaster, endotelceller, neurallist-härledda pericyter och andra mesenkymala celler 13-15. Bland dessa, TEC är avgörande vid de olika stadierna av T-cellsutveckling 1,2,16,17. Dock har bristen på ett robust sätt att isolera TEC försvårat en omfattande förståelse för deras funktion 16. Särskilt cTECs, som bildar ett tredimensionellt nätverk kring stamceller i hjärnbarken, är avgörande för positiv selektion 13,18,19 skäl som ännu inte är klar. Tidigare studier förutsatt ledtrådar till heterogenitet och roll TEC, främst förlita sig på morfologiska och histologiska verktyg 13 </sup>. Nyligen de unika roller TEC grupper behandlades av genetiska metoder i musmodeller 12,20. En robust och reproducerbart sätt att isolera TEC är grundläggande för att uppnå opartisk karakterisering av TEC undergrupper, kvantitativ och kvalitativ bedömning av TEC funktioner och förtydligande av mekanismer hur cTECs stödja positiva val.
På grund av sällsynthet TEC i tymus och snäva interaktioner bildar i intakta organ, har isoleringen av TEC varit utmanande. Protokollet som beskrivs här bygger på tidigare upptäckter, för närvarande tillgängliga reagens, tekniker och kunskap om bräss struktur och stromal sammansättning. Nästan två decennier sedan, har flera förfaranden rapporterades att dela upp bräss vävnader 21-27, där olika enzymer användes under matsmältningen, inklusive trypsin, kollagenas och Dispase. Gray et al. jämfört dessa enzymer i sin precedure 28, och redovisade ett förbättrat methOD med flera steg nedbrytning av enzym cocktails 29 som blev ofta används 20,30. Dock innebär en lång förberedelsetid och komplexa rötningssteg och resulterar i varierande final cell nummer och proportioner av TEC även inom samma mus kohort 29,30 denna metod. För flera år sedan, Liberase forskningskvalitet enzym, innehållande högrenat kollagenas och neutrala proteas började användas i thymus vävnadsdissociering 30. Här beskriver vi en Liberase digestion-baserat protokoll, med optimerade rutiner mekanisk separation, som ger ett stort antal livskraftiga TEC från mus bräss vävnader. .
Att berika dissocierade stromaceller, har tidigare studier använt antingen densitetsgradienter eller magnetiska pärla separation 21,29. Men båda metoderna orsaka allvarlig förlust av vissa populationer av tymiska stromaceller, särskilt befolkningen i cTECs 29. Cytotoxiska eliminering och panorering tekniker <sup> 31,32 har i stor utsträckning använts för utarmning eller separation av lymfocyter i den immunologiska fältet 12,31. Efter jämförelse av dessa tekniker har vi etablerat det nuvarande panorering protokoll för anrikning av TEC. Den milda tillstånd under förfarandet anriknings leder till mindre celldöd och opartisk och ökad TEC återhämtning.
Den isolerade bräss cellsuspensionen beskrivs i avsnitt 3 kan appliceras direkt på flödescytometrisk analys för identifiering och karakterisering av TEC delmängder och dendritiska celler. Avsnitt 4 beskriver ett enkelt och användbart sätt att identifiera TEC delmängder som använder multi flödescytometer. För experiment som syftar till att erhålla renade cTECs eller mTECs, TEC anrikning och cellsortering förfaranden finns i avsnitt 5 och 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protokollet, kritiska steg är att förbereda bräss stromaceller (avsnitt 3) och anrikning av TEC (avsnitt 4). Det rekommenderas starkt att färsk enzymlösning bereds varje gång och vävnaden behandlas så snart som möjligt. För poolade Thymi, är att optimera volymen av enzymlösning som krävs beroende på antalet Thymi. Om någon vävnad rester finns kvar efter behandling, kan lägga till mer enzymlösning och förlängning av inkubationstid öka cellutbytet. Under anrikning av TEC, slutföra samling av supern…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (till KAH). Vi tackar också University of Minnesota flödescytometri Resurs.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
Referências
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
- Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
- Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
- Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
- Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
- Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
- Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
- Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
- Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
- Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
- Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
- Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
- Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
- Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
- Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
- Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
- Shortman, K., Vremec, D., D’Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
- Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
- Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
- Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
- Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
- Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).
- Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).
- Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
- Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
- Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).
