בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל
Summary
כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.
Abstract
התימוס הוא איבר חיוני להתפתחות לימפוציטים T. של תאי סטרומה הרתי, תאים הרתי אפיתל (Tecs) הם קריטיים במיוחד בשלבים שונים של התפתחות תא T: מחויבות T תא, סלקציה חיובית וסלקציה שלילית. עם זאת, הפונקציה של Tecs בבלוטת התימוס נשארה הבינה באופן חלקי. במאמר, אנו מספקים שיטה לבודד תת TEC מבלוטת התימוס עכבר טרי באמצעות שילוב של הפרעה מכאנית ועיכול אנזימטי. השיטה מאפשרת לתאי סטרומה הרתי וthymocytes להשתחרר ביעילות מתאי תאים וחיבורי מטריצת תאים תאיים וכדי ליצור השעיה תא בודד. שימוש בתאים המבודדים, cytometry זרימת פרמטרים המרובה יכול להיות מיושם על זיהוי ואפיון של Tecs ותאים דנדריטיים. בגלל Tecs הוא אוכלוסיית תאים נדירה בבלוטת התימוס, אנחנו גם לתאר דרך יעילה להעשרה ולטהר Tecs ידי כלה thymocytes, סוג התא הנפוץ ביותר בבלוטת התימוס. Folloאגף ההעשרה, זמן מיון התא יכול להיות ירידה כל כך אובדן של כדאיות תא ניתן למזער במהלך הטיהור של Tecs. תאים מטוהרים מתאימים לניתוחים במורד הזרם שונים כמו Real Time-PCR, כתם מערבי ופרופיל ביטוי גנים. הפרוטוקול יהיה לקדם את המחקר של פונקצית TEC וכמו גם את הפיתוח של במבחנה הכינון מחדש של תאי T.
Introduction
בשלב מוקדם בהתפתחות תא T, אבות multipotent מח עצם גזע hematopoietic שמקורן בתאים מגויסים לקליפה של בלוטת התימוס, עובר מחויבות לשושלת T ולהיות מבשרי תא T 1. בקליפת המוח, השלילי כפול thymocytes מבשר תא T מסוג CD4 ו CD8 (DN) להרחיב ולהתמיין CD4 לא בוגר וthymocytes החיובי כפול CD8 (DP), ויצר מאגר גדול של אבות עם קולטני תא T משתנה מאוד 1. רק קבוצת משנה מוגבל-MHC נבחרת של תאי DP יהפוך החיובי יחיד thymocytes CD4 או CD8 (SP), לעבור למדולה של התימוס, ולהתמיין לתאי T בוגרים מבחינה תפקודית המוסמכים, אירוע שנקרא סלקציה חיובית כ2 6. בניגוד לכך, שיבוטים של thymocytes האוטומטי-reactive עוברים סלקציה שלילית ויוסרו באמצעות אפופטוזיס, יומרו לתאי T רגולטורים לסובלנות עצמית, או מופנים לימפוציטים intraepithelial למטרות שאינן ברורים עדיין 3,7-10.
בבלוטת התימוס, תאי סטרומה הרתי ליצור microenvironment ייחודי המספק אותות לאלה גורלות פיתוח תאים השונים T 5,11,12. תאי סטרומה הרתי מורכבים מתאי אפיתל הרתי (Tecs) – כולל Tecs קליפת המוח (cTECs) וTecs הלשדי (mTECs), תאים דנדריטיים, מקרופאגים, פיברובלסטים, תאי אנדותל, pericytes המופק מרכס העצבי ותאי mesenchymal אחרים 13-15. בין אלה, Tecs הם קריטיים בשלבים השונים של פיתוח תאי T 1,2,16,17. עם זאת, חוסר דרך חזקה כדי לבודד Tecs עכב הבנה מקיפה של הפונקציות שלהם 16. בפרט, cTECs, אשר יוצר רשת תלת ממדים המקיפה את האבות בקליפת המוח, חיוני לסלקציה חיובית 13,18,19 מסיבות שאינן ברורים עדיין. מחקרים קודמים סיפקו רמזים לגבי ההטרוגניות והתפקיד של Tecs, בעיקר להסתמך על כלים מורפולוגיים והיסטולוגית 13 </sup>. לאחרונה התפקידים הייחודיים של תת TEC טופלו על ידי גישות גנטיות בעכברי מודל 12,20. דרך חזקה ושחזור כדי לבודד Tecs היא יסוד להשגת אפיון משוחד של תת TEC, הערכה כמותית ואיכותית של פונקציות TEC, והבהרה של מנגנונים איך cTECs יתמוך בבחירה חיובית.
בשל הנדירות של Tecs בבלוטת התימוס והאינטראקציות הדוקות הם יוצרים באיבר שלם, הבידוד של Tecs היה מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על תגליות קודמות, כיום ריאגנטים זמינים, טכניקות, ואת הידע של מבנה בלוטת התימוס והרכב סטרומה. לפני כמעט שני עשורים, כמה נהלים דווחו לdisaggregate רקמות בלוטת התימוס 21-27, שבו אנזימים שונים שמשו במהלך עיכול, כולל טריפסין, Collagenase וDispase. אפור et al. לעומת אלה אנזימים בprecedure 28, ודיווח ספיד משופרod עם עיכול מרובה צעד של קוקטיילים אנזים 29 שהפכו בשימוש נרחב 20,30. עם זאת, שיטה זו כרוכה בזמן הכנה ארוך וצעדים מורכבים עיכול ותוצאות במשתנה מספרים סלולריים ופרופורציות של Tecs הסופי אפילו באותו הדור העכברי 29,30. לפני מספר שנים, אנזים כיתה מחקר Liberase, מכיל מטוהר ביותר Collagenase ופרוטאז הניטרלי התחיל להיות בשימוש בניתוק רקמת התימוס 30. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס עיכול Liberase, עם נהלי הפרדה מכאנית מותאמים, שמניב מספר גבוה של Tecs קיימא מרקמות בלוטת התימוס עכבר. .
כדי להעשיר את תאי סטרומה ניתק, מחקרים קודמים השתמשו גם מפלי צפיפות או הפרדת חרוז מגנטית 21,29. עם זאת, שתי השיטות לגרום חמורות אבודות של אוכלוסיות מסוימות של תאי סטרומה הרתי, במיוחד האוכלוסייה של cTECs 29. חיסול ציטוטוקסיות וטכניקות צילום פנורמי <sעד> 31,32 לי נרחב שימש במשך דלדול או הפרדה של לימפוציטים בתחום החיסוני 12,31. לאחר השוואה של טכניקות אלה, הקמנו את פרוטוקול צילום פנורמי הנוכחי להעשרה של Tecs. המצב העדין במהלך הליך ההעשרה מוביל למוות של תאים ופחות משוחד והתאוששות TEC מוגברת.
ההשעיה תא התימוס המבודדת שתוארה בסעיף 3 יכולה להיות מיושמת ישירות לזרום ניתוח cytometric לזיהוי ואפיון של תת TEC ותאים דנדריטיים. סעיף 4 מתאר דרך פשוטה ושימושית לזיהוי תת TEC באמצעות זרימת פרמטרים מרובה cytometer. ניתן למצוא בניסויים שמבקשים להשיג cTECs מטוהר או mTECs, העשרת TEC ומיון תא הליכים בסעיף 5 ו -6.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול, שלבים קריטיים הם ההכנה של תאי התימוס סטרומה (סעיף 3) וההעשרה של Tecs (סעיף 4). מומלץ מאוד שפתרון אנזים טרי מוכן בכל פעם, והוא התייחס אל הרקמה בהקדם האפשרי. לthymi נקווה, אופטימיזציה של הנפח של פתרון אנזים נדרש בהתאם למספר של thymi. אם כל שאריות רקמה שנשארו לאחר העיבוד, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט R01 AI088209 (לקה). אנו מודים גם לאוניברסיטת מינסוטה cytometry זרימת המשאבים.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
Referências
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
- Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
- Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
- Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
- Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
- Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
- Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
- Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
- Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
- Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
- Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
- Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
- Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
- Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
- Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
- Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
- Shortman, K., Vremec, D., D’Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
- Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
- Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
- Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
- Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
- Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).
- Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).
- Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
- Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
- Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).
