Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

Tidligt i T-celle udvikling, er knoglemarv hæmatopoietisk stamcelletransplantation afledt multipotente progenitorer rekrutteret til cortex af thymus, gennemgår engagement T afstamning og bliver T-celle forstadier ^1. I cortex, T-celle-prækursor CD4 og CD8 dobbelt negative (DN) thymocytter udvide og differentiere til umodne CD4 og CD8 dobbelt positive (DP) thymocytter, der udgør en stor pulje af stamfædre med meget variable T-cellereceptorer ^1. Kun en udvalgt MHC-begrænset delmængde af DP-celler bliver CD4 eller CD8 enkelt positive (SP) thymocytter, migrere til medulla thymus og differentierer til funktionelt kompetente modne T-celler, en hændelse, der betegnes som positiv selektion ^{2- 6.} I modsætning hertil kloner af auto-reaktive thymocyter gennemgå negativ udvælgelse og fjernes via apoptose, omregnet til regulatoriske T-celler til selv-tolerance, eller omdirigeret til intraepitel lymfocytter til formål, der endnu ikke klart ^3,7-10.

I thymus, thymus stromaceller danner en unik mikromiljø give signaler for disse forskellige T celle udvikling skæbne ^5,11,12. Thymiske stromaceller er sammensat af thymiske epitelceller (TECs) – herunder kortikale TEC (cTECs) og medullære TEC (mTECs), dendritiske celler, makrofager, fibroblaster, endotelceller, neurale crest-afledte pericytter og andre mesenchymale celler ^13-15. Blandt disse TEC er afgørende på de forskellige stadier af T-celle udvikling ^1,2,16,17. Imidlertid har manglen på en robust måde at isolere TEC hæmmet en bred forståelse af deres funktioner ^16. Især cTECs, der danner et tredimensionalt netværk omkring progenitorer i cortex, er afgørende for positiv selektion ^13,18,19 af årsager, der endnu ikke klart. Tidligere undersøgelser forudsat fingerpeg om heterogenitet og rolle TEC, for det meste afhængige af morfologiske og histologiske værktøjer ¹³ </sup>. For nylig de unikke roller TEC undergrupper blev behandlet af genetiske metoder i musemodeller ^12,20. En robust og reproducerbar måde at isolere TECs er afgørende for at opnå objektiv karakterisering af TEC delmængder, kvantitativ og kvalitativ vurdering af TEC funktioner og afklaring af mekanismer, hvordan cTECs understøtter positiv selektion.

På grund af sjældenheden af ​​TEC i thymus og de stramme interaktioner danner de i den intakte orgel er isoleringen af ​​TEC været udfordrende. Den her beskrevne protokol er baseret på tidligere opdagelser, pt tilgængelige reagenser, teknikker og viden om thymus struktur og stromale sammensætning. Næsten to årtier siden blev flere procedurer rapporteret at opdele thymus væv ^21-27, hvor forskellige enzymer blev anvendt under fordøjelsen, herunder trypsin, Collagenase og Dispase. Gray et al. sammenlignede disse enzymer i deres precedure ^28, og rapporterede en forbedret method med en multiple-trins fordøjelse af enzym cocktails ^29, der blev udbredt ^20,30. Men denne metode indebærer en lang forberedelsestid og komplekse fordøjelse trin og resultater i variabel endelige celletal og proportioner TEC selv i samme murine kohorte ^29,30. Flere år siden, Liberase forskning klasse enzym, der indeholder højt oprenset Collagenase og neutral protease begyndte at blive brugt i thymus væv dissociation ^30. Her beskriver vi en Liberase fordøjelse-baseret protokol, med optimerede mekaniske separationsprocedurer, der giver et højt antal levedygtige TEC fra muse thymus væv. .

At berige dissocierede stromaceller har tidligere undersøgelser anvendt enten densitetsgradienter eller separationsteknologi med magnetiske perler ^21,29. Men begge metoder forårsage alvorlig tabt af visse bestande af thymiske stromalceller, især befolkningen i cTECs ^29. Cytotoksisk eliminering og panorering teknik <sop> 31,32 har vidt været brugt til udtynding eller separation af lymfocytter i den immunologiske felt ^12,31. Efter sammenligning af disse teknikker, vi etableret den aktuelle panorering protokol for berigelse af TEC. Den blide tilstand under proceduren berigelse fører til mindre celledød og fordomsfri og øget TEC opsving.

Den isolerede thymus cellesuspension beskrevet i punkt 3 kan anvendes direkte flowcytometrianalyse til identifikation og karakterisering af TEC delmængder og dendritiske celler. Afsnit 4 beskriver en enkel og brugbar måde at identificere TEC delmængder anvender multiparameter flowcytometer. Til eksperimenter, der søger at opnå oprensede cTECs eller mTECs TEC berigelse og cellesortering procedurer kan findes i afsnit 5 og 6.