Her beskriver vi en effektiv fremgangsmåde til isolering, identifikation og oprensning af muse thymiske epitelceller (TECs). Protokollen kan bruges til undersøgelser af thymus funktion for en normal T-celle udvikling, thymus-dysfunktion, og T-celle rekonstitution.
Thymus er et vigtigt organ for T-lymfocyt-udvikling. Thymuslidelser stromalceller, thymiske epitelceller (TECs) er særligt afgørende på flere stadier af T-celle udvikling: T-celle engagement, positiv udvælgelse og negativ udvælgelse. Imidlertid forbliver funktion TEC i thymus ufuldstændigt forstået. I artiklen giver vi en metode til at isolere TEC delmængder fra frisk mus thymus ved hjælp af en kombination af mekanisk sprængning og enzymatisk nedbrydning. Metoden giver mulighed for thymiske stromale celler og thymocytter til effektivt frigivet fra celle-celle og celle-ekstracellulær matrix-forbindelser og til at danne en enkelt-celle suspension. Brug af isolerede celler, kan multiparameter flowcytometri anvendes til identifikation og karakterisering af TEC og dendritiske celler. Fordi TEC er en sjælden cellepopulation i thymus, vi beskriver også en effektiv måde at berige og oprense TEC ved at nedbryde thymocytter, den mest rigelige celletype i thymus. Follofløj berigelsen, cellesortering tid kan reduceres, således at tab af levedygtighed celle kan minimeres under oprensning af TEC. Rensede celler er egnet til forskellige downstream analyser som Real Time-PCR, Western blot og genekspression profilering. Protokollen vil fremme forskning TEC funktion og samt udvikling af in vitro-T-celle rekonstitution.
Tidligt i T-celle udvikling, er knoglemarv hæmatopoietisk stamcelletransplantation afledt multipotente progenitorer rekrutteret til cortex af thymus, gennemgår engagement T afstamning og bliver T-celle forstadier 1. I cortex, T-celle-prækursor CD4 og CD8 dobbelt negative (DN) thymocytter udvide og differentiere til umodne CD4 og CD8 dobbelt positive (DP) thymocytter, der udgør en stor pulje af stamfædre med meget variable T-cellereceptorer 1. Kun en udvalgt MHC-begrænset delmængde af DP-celler bliver CD4 eller CD8 enkelt positive (SP) thymocytter, migrere til medulla thymus og differentierer til funktionelt kompetente modne T-celler, en hændelse, der betegnes som positiv selektion 2- 6. I modsætning hertil kloner af auto-reaktive thymocyter gennemgå negativ udvælgelse og fjernes via apoptose, omregnet til regulatoriske T-celler til selv-tolerance, eller omdirigeret til intraepitel lymfocytter til formål, der endnu ikke klart 3,7-10.
I thymus, thymus stromaceller danner en unik mikromiljø give signaler for disse forskellige T celle udvikling skæbne 5,11,12. Thymiske stromaceller er sammensat af thymiske epitelceller (TECs) – herunder kortikale TEC (cTECs) og medullære TEC (mTECs), dendritiske celler, makrofager, fibroblaster, endotelceller, neurale crest-afledte pericytter og andre mesenchymale celler 13-15. Blandt disse TEC er afgørende på de forskellige stadier af T-celle udvikling 1,2,16,17. Imidlertid har manglen på en robust måde at isolere TEC hæmmet en bred forståelse af deres funktioner 16. Især cTECs, der danner et tredimensionalt netværk omkring progenitorer i cortex, er afgørende for positiv selektion 13,18,19 af årsager, der endnu ikke klart. Tidligere undersøgelser forudsat fingerpeg om heterogenitet og rolle TEC, for det meste afhængige af morfologiske og histologiske værktøjer 13 </sup>. For nylig de unikke roller TEC undergrupper blev behandlet af genetiske metoder i musemodeller 12,20. En robust og reproducerbar måde at isolere TECs er afgørende for at opnå objektiv karakterisering af TEC delmængder, kvantitativ og kvalitativ vurdering af TEC funktioner og afklaring af mekanismer, hvordan cTECs understøtter positiv selektion.
På grund af sjældenheden af TEC i thymus og de stramme interaktioner danner de i den intakte orgel er isoleringen af TEC været udfordrende. Den her beskrevne protokol er baseret på tidligere opdagelser, pt tilgængelige reagenser, teknikker og viden om thymus struktur og stromale sammensætning. Næsten to årtier siden blev flere procedurer rapporteret at opdele thymus væv 21-27, hvor forskellige enzymer blev anvendt under fordøjelsen, herunder trypsin, Collagenase og Dispase. Gray et al. sammenlignede disse enzymer i deres precedure 28, og rapporterede en forbedret method med en multiple-trins fordøjelse af enzym cocktails 29, der blev udbredt 20,30. Men denne metode indebærer en lang forberedelsestid og komplekse fordøjelse trin og resultater i variabel endelige celletal og proportioner TEC selv i samme murine kohorte 29,30. Flere år siden, Liberase forskning klasse enzym, der indeholder højt oprenset Collagenase og neutral protease begyndte at blive brugt i thymus væv dissociation 30. Her beskriver vi en Liberase fordøjelse-baseret protokol, med optimerede mekaniske separationsprocedurer, der giver et højt antal levedygtige TEC fra muse thymus væv. .
At berige dissocierede stromaceller har tidligere undersøgelser anvendt enten densitetsgradienter eller separationsteknologi med magnetiske perler 21,29. Men begge metoder forårsage alvorlig tabt af visse bestande af thymiske stromalceller, især befolkningen i cTECs 29. Cytotoksisk eliminering og panorering teknik <sop> 31,32 har vidt været brugt til udtynding eller separation af lymfocytter i den immunologiske felt 12,31. Efter sammenligning af disse teknikker, vi etableret den aktuelle panorering protokol for berigelse af TEC. Den blide tilstand under proceduren berigelse fører til mindre celledød og fordomsfri og øget TEC opsving.
Den isolerede thymus cellesuspension beskrevet i punkt 3 kan anvendes direkte flowcytometrianalyse til identifikation og karakterisering af TEC delmængder og dendritiske celler. Afsnit 4 beskriver en enkel og brugbar måde at identificere TEC delmængder anvender multiparameter flowcytometer. Til eksperimenter, der søger at opnå oprensede cTECs eller mTECs TEC berigelse og cellesortering procedurer kan findes i afsnit 5 og 6.
I protokollen, kritiske trin er fremstillingen af thymus stromale celler (afsnit 3) og berigelsen af TEC (afsnit 4). Det anbefales kraftigt, at frisk enzym opløsning fremstilles hver gang og vævet behandles så hurtigt som muligt. Til poolet thymi, optimerer mængden af enzymopløsning kræves afhængigt af antallet af thymi. Hvis væv rester efter behandlingen, kan tilføje mere enzymopløsning og udvidelse af inkubationstiden øges celleudbytte. Under berigelse af TEC, færdiggøre indsamling af su…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (til KAH). Vi takker også University of Minnesota flowcytometri ressource.
Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |