Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali
Summary
Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.
Abstract
Il timo è un organo vitale per lo sviluppo dei linfociti T. Di cellule stromali del timo, le cellule epiteliali timiche (TEC) sono particolarmente cruciali in più stadi di sviluppo delle cellule T: l'impegno delle cellule T, selezione positiva e selezione negativa. Tuttavia, la funzione del TEC nel timo rimane completamente compresa. Nell'articolo, mettiamo a disposizione un metodo per isolare sottoinsiemi TEC da topo fresco timo utilizzando una combinazione di perturbazione meccanica e digestione enzimatica. Il metodo permette di cellule stromali timiche e timociti per essere efficacemente rilasciato dalla cellula-cellula e connessioni cellula-matrice e per formare una cella singola sospensione. Usando le cellule isolate, citometria a flusso multiparametrica può essere applicato alla identificazione e caratterizzazione di TEC e cellule dendritiche. Perché TEC sono una rara popolazione di cellule nel timo, anche noi descriviamo un modo efficace per arricchire e purificare TEC mediante deplezione timociti, il tipo cellulare più abbondante nel timo. Folloala l'arricchimento, cell sorting tempo può essere ridotto in modo che la perdita di vitalità cellulare può essere minimizzato durante la purificazione della TEC. Cellule purificate sono adatti per varie analisi a valle come Real Time-PCR, Western blot e profilo di espressione genica. Il protocollo promuoverà la ricerca della funzione TCE e così come lo sviluppo di ricostituzione in vitro di cellule T.
Introduction
All'inizio lo sviluppo delle cellule T, midollo osseo di cellule staminali ematopoietiche derivate da progenitori multipotenti sono reclutati alla corteccia del timo, sottoposto impegno a T lignaggio e diventare precursori delle cellule T 1. Nella corteccia, precursori delle cellule T CD4 e CD8 doppio negativi (DN) timociti espandersi e differenziarsi in immaturo CD4 e CD8 doppio positivi (DP) timociti, formando una grande piscina di progenitori ai ricettori cellulari altamente variabile T 1. Solo una select sottoinsieme MHC-ristretto di cellule DP diventerà singolo positivi (SP) timociti CD4 o CD8, migrare verso il midollo del timo, e differenziarsi in cellule funzionalmente competenti T maturi, un evento che si riferisce alla selezione come positivo 2 6. Al contrario, cloni di timociti auto-reattivi sottoposti a selezione negativa e vengono rimossi tramite apoptosi, convertito in cellule T regolatorie per l'auto-tolleranza, o deviato verso linfociti intraepiteliali per scopi che non sono ancora chiare 3,7-10.
Nel timo, cellule stromali del timo formano un microambiente unico che fornisce segnali per questi diversi destini di sviluppo delle cellule T 5,11,12. Cellule stromali del timo sono composti da cellule epiteliali timiche (TEC) – tra cui TEC corticali (CTEC) e TEC midollari (mTECs), cellule dendritiche, macrofagi, fibroblasti, cellule endoteliali, periciti derivati dalla cresta neurale e di altre cellule mesenchimali 13-15. Tra questi, TEC sono cruciali nelle varie fasi di sviluppo delle cellule T 1,2,16,17. Tuttavia, la mancanza di un modo affidabile per isolare TEC ha impedito una comprensione globale delle loro funzioni 16. In particolare, CTEC, che formano una rete tridimensionale progenitori nella corteccia circostante, sono essenziali per la selezione positiva 13,18,19, per ragioni che non sono ancora chiare. Studi precedenti fornito indizi utili a capire l'eterogeneità e il ruolo di TEC, per lo più basandosi su strumenti morfologici e istologici 13 </sup>. Recentemente i ruoli unici di sottoinsiemi TEC sono state affrontate con approcci genetici in modelli murini 12,20. Un modo affidabile e riproducibile per isolare TEC è fondamentale per raggiungere la caratterizzazione imparziale di sottoinsiemi TEC, valutazione quantitativa e qualitativa delle funzioni TEC, e chiarimento dei meccanismi come CTEC supportano la selezione positiva.
A causa della rarità della TEC in timo e le interazioni strette formano nell'organo intatto, l'isolamento di TEC è stato impegnativo. Il protocollo qui descritto è basato sulle scoperte precedenti, attualmente reagenti disponibili, le tecniche e la conoscenza della struttura del timo e della composizione stromale. Quasi due decenni fa, sono stati segnalati diverse procedure di disaggregare i tessuti timo 21-27, in cui i diversi enzimi sono stati usati durante la digestione, tra cui tripsina, Collagenase e dispasi. Grigio et al. comparano questi enzimi nella loro precedure 28, e ha registrato un miglioramento method una digestione più fasi di cocktail di enzimi 29 che si sono resi ampiamente utilizzato 20,30. Tuttavia, questo metodo richiede un lungo tempo di preparazione e mineralizzazione complessi e risultati in variabile finale numero di cellule e proporzioni di TEC anche nella stessa coorte murino 29,30. Diversi anni fa, Liberase grado di ricerca enzima, contenenti altamente purificato Collagenase e proteasi neutra cominciò ad essere utilizzato nel tessuto del timo dissociazione 30. Qui, descriviamo un protocollo basato digestione Liberase, con procedure di separazione meccanica ottimizzate, che produce un elevato numero di TEC vitali dai tessuti del mouse timo. .
Per arricchire cellule stromali dissociate, studi precedenti hanno utilizzato sia gradienti di densità o di separazione tallone magnetica 21,29. Tuttavia, entrambi i metodi causano grave perdita di alcune popolazioni di cellule stromali del timo, in particolare la popolazione di CTEC 29. Eliminazione citotossici e tecniche di panning <sup> 31,32 sono stati ampiamente utilizzati per esaurimento o separazione dei linfociti nel campo immunologica 12,31. Dopo il confronto di queste tecniche, abbiamo stabilito il protocollo panning attuale per l'arricchimento della TEC. La condizione delicata durante la procedura di arricchimento porta a meno morte cellulare e imparziale e maggiore recupero TEC.
La sospensione di cellule isolate timo descritto nella Sezione 3 può essere applicato direttamente alle analisi citofluorimetrica per l'identificazione e la caratterizzazione dei sottoinsiemi TEC e cellule dendritiche. Sezione 4 descrive un modo semplice e utile per identificare sottoinsiemi TEC utilizzando il flusso multiparametrica citometro. Per gli esperimenti che cercano di ottenere CTEC purificate o mTECs, TEC arricchimento e cell sorting procedure può essere trovato nella sezione 5 e 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel protocollo, punti critici sono la preparazione di cellule stromali del timo (sezione 3) e l'arricchimento di TEC (sezione 4). Si raccomanda vivamente che la soluzione enzimatica fresca viene preparata ogni volta e il tessuto viene trattato il più presto possibile. Per thymi studiata, ottimizzando il volume della soluzione enzimatica è richiesta a seconda del numero di thymi. Se eventuali residui di tessuto viene lasciato dopo l'elaborazione, aggiungendo più soluzione enzimatica e l'estensione del temp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health di Grant R01 AI088209 (a KAH). Ringraziamo anche l'Università del Minnesota Citometria a flusso di risorse.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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