Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A<em> Trichoderma reesei</em> Em Plantas de tabaco

Degradação de biomassa lignocelulósica e sua conversão em combustível líquido foi concebido como um método para reduzir a dependência dos combustíveis fósseis. Um obstáculo significativo na criação de sistemas de processamento de biomassa é economicamente viáveis ​​na degradação enzimática da celulose e hemicelulose ^1. Os sistemas de expressão de plantas apresentam um grande potencial para a produção de enzimas a uma escala industrial. Agricultura, sistemas para instalações de colheita economicamente e em termos de volume já estão estabelecidos, como têm sido há milhares de anos. A produção de celulases em plantas é desejável devido a factores tais como a facilidade de autohydrolysis ^2, e o potencial para maximizar o uso de níveis mais baixos de enzima, aumentando a digestibilidade das paredes das células das plantas ^1. Finalmente, sistemas de plantas permitir o direccionamento das proteínas recombinantes para áreas específicas de células de plantas e são capazes de modificar posttranslationally enzimas onde requeridas ^3.

Nicotiana tabacum (tabaco) é muito comumente utilizado como um organismo modelo para estudos de expressão de proteínas heterólogas em plantas, devido ao seu rápido crescimento e de biomassa de acumulação de recursos ^4. A expressão transitória de proteínas recombinantes é uma técnica que permite a produção de proteína em períodos de tempo curtos ^5, enquanto mantém a flexibilidade como para a localização e, portanto, as modificações pós-traducionais das proteínas seleccionadas, ou seja, celulases. Isso permite a produção de celulase (s) para a análise básica, ao mesmo tempo, preparando o terreno para novas estratégias de expressão em plantas. Usando essa estratégia expressão transitória, uma endoglucanase de glicosil hidrolases da família 5, Cel5A, derivado do hospedeiro do fungo Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) ⁶ é produzido (doravante referida como TrCel5A). TrCel5A é uma proteína de 42 kDa, que é nativamente glicosilada e é altamente ativo em hidráulicaroylzing cadeias de celulose ^7.

A técnica de expressão transitória descrito aqui baseia-se num sistema relativamente comumente utilizado, infiltrando-se as folhas das plantas com a Agrobacterium transportando o gene de interesse num vector de expressão apropriado. Para permitir a análise rápida de expressão bem sucedida em planta, TrCel5A também pode ser expressa como uma proteína de fusão com mCherry, uma proteína fluorescente monomérica originalmente derivada de Discosoma sp. Proteína dsRed ^8, com um período adicional de seis resíduos de histidina (His-tag) fundido com a o C-terminal (TrCel5A-mCherry). Expressão da proteína de fusão heteróloga, TrCel5A-mCherry, pode, assim, ser controlada dentro da planta em crescimento usando luz verde para examinar mCherry dispersão. Se desejado, as secções finas de material de planta pode ser examinado sob luz verde ao microscópio para estabelecer a localização específica da proteína. Para este trabalho, sinal e transentar péptidos foram incorporadas na construção para a localização da exportação da proteína heteróloga para o retículo endoplasmático ^9.

Para analisar a actividade de plantas, incluindo as celulases expressas TrCel5A, uma série de testes de actividade de celulase pode ser executado. Após a extracção do total de proteínas vegetais solúveis, TrCel5A podem ser parcialmente purificadas utilizando uma técnica de incubação térmica. O tamanho da proteína é efectuada por meio de SDS-PAGE seguido por Western blot. Zimografia pode ser utilizado para analisar a actividade contra os substratos, por exemplo, de celulose, que foi carboxi-metilado (fazendo carboximetilcelulose: CMC) para a solubilidade ^10. Actividade de celulase e glicosidase pode ser monitorizada utilizando o fluoróforo 4-metilumbeliferilo (4-MU), associada com β-D-celobiósido (combinados: 4-MUC). Outro método para avaliar a actividade de endoglucanase envolve a análise de espectrometria de CMC que tem sido associado com um azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) ^11. Além disso, a actividade da proteína de ambas as endoglucanases e uma variedade de celulases pode ser monitorizado pela utilização de um teste de análise de açúcar, tais como a hidrazida de p-hidroxi-benzóico (PAHBAH) ensaio de ^12. Estas técnicas podem ser utilizados para elucidar e quantificar a actividade da celulase expressa de interesse.