Summary

Demonstrando um multi-resistente<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Ampliação Microarray

Published: April 25, 2014
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Summary

Um microarray amplificação combina assimétrica PCR amplificação e hibridização microarray em uma única câmara, que simplifica significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final. Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de diagnósticos à base de microarray que podem ser rotineiramente usados ​​em ambientes com recursos mais baixos.

Abstract

Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de MDR-TB diagnósticos baseados em microarray que podem ser rotineiramente usados ​​em ambientes com recursos mais baixos. Um microarray amplificação combina amplificação PCR assimétrico, a seleção tamanho do alvo, rotulagem alvo, e hibridização microarray dentro de uma única solução e em uma única câmara microfluídicos. Um método de processamento em lote é demonstrada com uma mistura mestre assimétrica 9-plex e baixa densidade elemento gel microarray para a genotipagem da multi-droga resistente Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). O protocolo aqui descrito pode ser concluída em 6 horas e fornecer genotipagem correcta com, pelo menos, 1.000 equivalentes de células de ADN genómico. A incorporação no chip passos de lavagem é possível, o que irá resultar num método amplicão totalmente fechada e sistema. O grau de multiplexagem, com um microarray de amplificação é relacionada ao número de pares de iniciadores que podem ser combinados num único mestre mix e ainda atingir a sensibilidade desejada e as métricas de desempenho especificidade, em vez do número de sondas que são imobilizados na matriz. Do mesmo modo, o tempo total de análise pode ser reduzido ou aumentado, dependendo do uso específico a que se destinam, questão de pesquisa, e limites desejados de detecção. No entanto, a abordagem geral agiliza significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final, reduzindo o número de etapas de processamento manualmente intensivos e demorados, e fornece um caminho bioquímico e microfluídicos simplificado para traduzir diagnósticos baseados em microarrays para a prática clínica de rotina.

Introduction

Detecção precoce de casos e tratamento rápido são consideradas as estratégias de controle mais eficazes para reduzir o Mycobacterium tuberculosis (MTB) Transmissão 1, e agora há um amplo consenso na comunidade TB que um ponto de atendimento (POC) ou próximo teste POC para diagnosticar simultaneamente TB e resistência a drogas (DR) é necessária. Tecnologias como GeneXpert de Cepheid e outros testes de amplificação de ácidos nucleicos reduzir o tempo de diagnóstico para muitos pacientes com TB, e proporcionar uma leitura rápida, indicando resistência à rifampicina ou mutações que conferem resistência selecionados para outros de primeira ou segunda linha de medicamentos 2. Embora ensaios de amplificação em tempo real e de ácidos nucleicos isotérmica são concebidos para identificar as mutações de resistência a drogas que levam a MDR-TB, o espectro de mutações que detectam é muitas vezes inadequada para conceber um regime de droga individualizada correspondente ao perfil de resistência a drogas do paciente, e as restrições técnicas relacionadasde cross-talk óptico ou a complexidade da amplificação e relatórios químicos 03-07 maio limitar o número de loci ou mutações que são detectados. Assim, tecnologias de detecção com maior capacidade de multiplexação são necessárias para suprir as lacunas conhecidas em diagnósticos POC MDR-TB.

Microarrays e Hain ensaios sonda linha OMS endossadas pode resolver o "gene múltiplo, mutações" desafio de diagnosticar MDR-TB 8-29. Infelizmente, estes, plataformas de detecção multiplexados baseada hibridização usar várias etapas, complicado, e protocolos de amplicon aberto que exigem treinamento e proficiência significativo em técnicas moleculares. O microarray amplificação 30 foi projetado para atender algumas dessas preocupações operacionais microarray work-flow e. Os princípios fluídicos simplificadoras são para amplificar, hibridizar e detectar alvos de ácido nucléico em uma única câmara microfluídicos. O usuário introduz os ácidos nucléicos e amplificação master misturar em uma câmara de fluidos, com uma pipeta e inicia o protocolo de ciclos térmicos. Para o método de processamento do lote mostrado aqui, microarrays são subsequentemente lavadas em solução a granel, seca e fotografada. Este estudo demonstra a funcionalidade de um microarray de amplificação, utilizando um teste de MDR-TB microarray para rpoB (30 mutações), KatG (2 mutações), inhA (4 mutações), rpsL (2 mutações), embB (1 mutação), IS1245, IS6110 , e uma amplificação interna e controlo de hibridação. Pelo menos um par correspondente de sondas de microarray (de tipo selvagem (WT) e mutantes de um único nucleótido (MU)) é incluído para cada mutação de interesse. Ácidos nucleicos purificados de M. multirresistente tuberculose são do Strain TDR Tuberculose Banco 31. Microarrays elemento Gel são fabricados em substratos de vidro por copolimerização essencialmente como descrito em outra parte 32, só que usamos 4% e 0,05 mM monômero cada sonda no polymerizmistura ção. As matrizes são rodeados por uma junta de 50 ml, antes da utilização. Depois de ciclos térmicos, hibridação, lavagem e passos, microarrays de amplificação são gravadas em um analisador portátil Akonni. Correção de fundo, intensidades de sinal integrados são obtidos a partir da matéria. Imagens tif usando um algoritmo círculo fixo. Ruído para cada elemento de gel é calculado como três vezes o desvio padrão da mancha de fundo locais. Genes alvos são normalmente considerados detectável por sinal-ruído (SNR) de valores ≥ 3. A fim de determinar a presença ou ausência de uma mutação específica no gene ou cada codão, um rácio discriminante é calculado a partir dos valores de SNR como (WT-MU) / (TP + MU). Rácios discriminantes <0 são indicativos de uma mutação de resistência a drogas no local, enquanto que os rácios> 0 são indicativos da sequência de tipo selvagem.

Protocol

Para laboratórios que seguem as precauções universais de PCR, é operacionalmente mais eficiente para incluir várias microarrays de amplificação e juntas por substrato e lavar todos os microarrays de amplificação simultaneamente em um recipiente a granel, como descrito aqui. Formatos de consumo estão disponíveis para a realização de pós-amplificação etapas de lavagem microarray em um totalmente selado, teste amplicon fechado, como relatado em outros lugares 30,33. 1. …

Representative Results

Análise de imagem qualitativa pode fornecer informações sobre as fontes de ruído experimental ou variabilidade que são difíceis de identificar em tabelas de dados gerados pelo software automatizado de análise de imagem. Assim, ele pode ser útil para determinar visualmente que 1) todos os elementos de gel estão intactos e não danificado, 2) o fundo global é livre de artefactos fluorescentes que podem afectar o sinal individual de valores de ruído (SNR), 3), não há evidência de formação de bolhas ou não …

Discussion

O grau de multiplexagem, com um microarray de amplificação é, em última análise ditada pela eficácia do multiplex PCR assimétrica, não o microarray. Em nossa experiência, 10-12 pares de primers exclusivos podem ser facilmente multiplexados em um formato amplificação microarray. Critérios de primers e sonda de design convencionais, portanto, aplicar-se a novos testes, a não ser que a pessoa também precisa considerar possíveis interações entre os ácidos nucléicos em fase de solução e sondas de microar…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH), sob concessão RC3 AI089106.

MDR-TB ácidos nucléicos foram fornecidos por / Programa das Nações Unidas Programa Fundo / United Nations Development do Banco Mundial / Organização Mundial da Saúde Especial para Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais (TDR), Genebra, Suíça.

Agradecemos ao Dr. Tom Shinnick dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças para orientação sobre os genes e mutações específicas para incluir no ensaio do protótipo.

Materials

MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Equipment Company  Catalog Number 
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

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Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

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