Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью<em> Микобактерии туберкулеза</em> Усиление микрочипов
Summary
Усиление микрочипов сочетает асимметричный ПЦР-амплификации и микрочипов гибридизации в одной камеры, что значительно упрощает микрочипов рабочий процесс для конечного пользователя. Упрощение микрочипов рабочий процесс является необходимым первым шагом для создания микрочипов методы диагностики, которые могут быть обычно используются в средах ниже ресурсами.
Abstract
Упрощение микрочипов рабочий процесс является необходимым первым шагом для создания МЛУ-ТБ микрочипов методы диагностики, которые могут быть обычно используются в средах ниже ресурсами. Усиление микрочипов сочетает асимметричный ПЦР-амплификации, выбор целевой размер, целевой маркировки и микрочипов гибридизации в рамках одного решения и в единый микрофлюидных камеры. Метод пакетной обработки демонстрируется с 9-Plex асимметричной мастер-микса и низкой плотности гель элемента микрочипов для генотипирования с множественной лекарственной устойчивостью микобактерий туберкулеза (МЛУ-ТБ). Протокол, описанный здесь может быть завершена в 6 часов и обеспечивают правильную генотипирование с по крайней мере 1000 клеток эквивалентов геномной ДНК. Включение на чипе стадий промывки является возможным, что приведет к совершенно закрытым способом ампликона и системы. Степень мультиплексирования с амплификации микрочипов, в конечном счете ограничены по количеству пар праймеров, которые могут быть объединены в один мастер-мIX и до сих пор достичь желаемого чувствительность и специфичность метрики производительности, а не от количества датчиков, которые, иммобилизованных на матрице. Кроме того, общее время анализа можно укорачивать или удлинять в зависимости от конкретной цели использования, вопрос исследования и желанных пределов обнаружения. Тем не менее, общий подход значительно упрощает микрочипов рабочий процесс для конечного пользователя за счет уменьшения количества вручную интенсивных и трудоемких этапов обработки, и обеспечивает упрощенную биохимический и микрофлюидных путь для перевода микрочипов методы диагностики, в повседневной клинической практике.
Introduction
Раннего выявления и быстрого лечения считаются наиболее эффективные стратегии, направленные на снижение микобактерии туберкулеза (МТБ) передачи 1, и в настоящее время существует широкий консенсус в обществе ТБ, что точка ухода (ЛОК) или вблизи теста ЛОК одновременно диагностировать туберкулез и лекарственная устойчивость (DR) не требуется. Такие технологии, как GeneXpert Cepheid и других испытаний нуклеиновых кислот усиления сократить время постановки диагноза для многих больных туберкулезом, и обеспечивают быстрое считывание, показывающее устойчивость к рифампицину или отдельных мутаций, придающих устойчивость к другим первой или второй линии препаратов 2. Хотя в режиме реального времени и изотермический нуклеиновых кислот тесты амплификации предназначены для выявления мутаций лекарственной устойчивости, которые приводят к МЛУ-ТБ, спектр мутаций они обнаруживают, часто бывает неадекватной для разработки индивидуальной схеме наркотиков, соответствующую профилю лекарственной устойчивости пациента, и технические ограничения, связанныек оптическому перекрестных помех или сложности амплификации и отчетности химических 3-7 может ограничить число локусов или мутаций, которые были обнаружены. Таким образом, технологии обнаружения с высокой емкостью мультиплексирования требуются для решения известных пробелов в МЛУ-ТБ диагностики POC.
Microarrays и ВОЗ одобрила Hain линия зонда анализы могут обратиться к "несколько генов, множественные мутации" вызов диагностики МЛУ-ТБ 8-29. К сожалению, эти гибридизации основе, мультиплексированных платформы обнаружения использовать многоступенчатой, сложной и открытой Amplicon протоколы, которые требуют значительной подготовки и квалификации в молекулярных методов. Усиление микрочипов 30 был разработан, чтобы решить некоторые из этих микрочипов рабочий процесс и оперативных проблем. Упрощающие струйные принципы для усиления, гибридизации, и обнаруживать цели нуклеиновых кислот в пределах одного микрофлюидных камеры. Пользователь вводит кислоты и усиления мас нуклеиновыхтер смешать в текучей камере с помощью пипетки и начинает протокол тепловой велоспорт. Для метода пакетной обработки, показанной здесь, микрочипы которые затем промывают в объеме раствора, сушат и образ. Это исследование демонстрирует функциональность амплификации микрочипов с использованием тест МЛУ-ТБ микрочипов для гена rроВ (30 мутаций), katG (2 мутации), Инга (4 мутации), RPSL (2 мутации), embB (1 мутация), IS1245, IS6110 и внутреннее усиление и управление гибридизации. По крайней мере один подобранная пара из микрочипов зондов (дикого типа (WT) и одного нуклеотида мутантных (MU)) включена в каждый мутации интерес. Очищенные нуклеиновые кислоты от множественной лекарственной устойчивостью М. туберкулез от TDR туберкулеза штамма банк 31. Гель элемент микрочипы изготавливаются на стеклянных подложках сополимеризацией существу, как описано в другом месте 32, за исключением того, мы используем 4% мономера и 0,05 мм каждый зонд в polymerizAtion смесь. Массивы окружены 50 мл прокладки до использования. После термоциклирования, гибридизации и промывки шагов, усиления микрочипы изображаются на Akonni портативного анализатора. Фоновые коррекцией, интегральные интенсивности сигналов получаются из сырой. TIF изображений с помощью фиксированный алгоритм круг. Шума для каждого элемента гель рассчитывается как три раза стандартного отклонения фонов местных месте. Генные цели, как правило, считается обнаружить для сигнала к шуму (SNR) значения ≥ 3. Для того, чтобы определить наличие или отсутствие определенной мутации в гене или каждого кодона, дискриминант коэффициент рассчитывается по значениям SNR как (WT-MU) / (WT + MU). Дискриминантные отношения <0 свидетельствуют о лекарственной устойчивости мутации в локусе, в то время как отношения> 0 указывают на последовательность дикого типа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Степень мультиплексирования с амплификации микрочипов, в конечном счете диктуется эффективности мультиплексной асимметричной ПЦР, а не микрочипов. По нашему опыту, 10-12 уникальных пары праймеров может быть легко мультиплексирован в формате усиления микрочипов. Поэтому обычные прайме…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (NIH) под грант RC3 AI089106.
МЛУ-ТБ нуклеиновые кислоты были предоставлены Программой развития / Фонда Организации Объединенных Наций / Всемирного Специальной программы банк / World помощи детям Организации Объединенных Наций организации здравоохранения по исследованиям и подготовке специалистов в области тропических болезней (ТБИ), Женева, Швейцария.
Мы благодарим доктора Тома Шинник из Центров США по контролю и профилактике заболеваний для руководства о конкретных генов и мутаций, чтобы включить в анализе прототипа.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
Referências
- Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. . Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
