Summary

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em> Chlamydia</em> Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

Published: October 13, 2015
doi:

Summary

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Abstract

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

Infektionskrankheiten durch Arten der intrazelluläre Bakterium Chlamydia verursacht entlocken eine große Belastung für die globale Gesundheit, einschließlich sexuell übertragbare Krankheit, entzündliche Erkrankungen des Beckens, Blindheit, Pneumonie und möglicherweise Atherosklerose 1-4. Die Fähigkeit von Chlamydia um mit der Wirtszelle wechselwirken, innerhalb einer Vakuole (genannt die Aufnahme), ist ein kritischer Faktor für die erfolgreiche Infektion von Zellen und dem Host. Die Aufnahme ist eine neuartige pathogenen Fach, die Chlamydien-Wachstum ermöglicht und wird dynamisch über die gesamte 2-3 Tag Entwicklungszyklus von Chlamydia 5 modifiziert. Die obligat intrazelluläre Natur der Chlamydien stellt zahlreiche Herausforderungen für die Forschung, insbesondere für direkt an das Studium der einzigartigen Biologie der Eingliederung. Ein großes Handicap war die Unfähigkeit, entweder intrazellulären Chlamydien oder ihre Aufnahme von Fluoreszenz Ansatz effizient visualisierenes in lebenden Zellen. Eine neue Entdeckung hat endlich enthüllt die Mittel, um GFP-exprimierenden C. generieren trachomatis 6; aber dieses Ergebnis noch nicht auf eine spezifische Markierung der Aufnahme geführt. Einige Techniken zur Markierung von Bakterien und Einschlüsse 7,8 beschrieben worden, aber sie Mängel auf, wie nicht-Spezifität transiency und die Anfälligkeit gegen Ausbleichung leiden. Ein Schlüssel Entdeckung von unserer Arbeitsgruppe gegründet, eine neue Strategie für die Beleuchtung der Aufnahme mit GFP-exprimierenden Wirtszellen 9. Diese Strategie rationell nutzt die intrinsische Undurchlässigkeit der Einschlußmembran bis größer als 520 Da 10 Molekülen. Wenn Zellen entwickelt, um stabil eine bestimmte cytosolische fluoreszierende Protein (zB GFP oder mCherry) zum Ausdruck bringen, sind Chlamydia Einschlüsse mit außergewöhnlicher Klarheit durch ihre vollständigen Ausschluss der Fluoreszenz sichtbar. Diese umgekehrte Imaging-Strategie ermöglicht eine sofortige Visualisierung von Einschlüssen für alle Chlamydia Arten und es kann leicht für die meisten Wirtszellen von Interesse angepasst werden. Als Demonstration der Nützlichkeit wurde dieses Verfahren bisher verwendeten zu offenbaren und zu definieren, die zellulären Austrittswege für Chlamydia spp 9.

Hier haben wir weiter zu zeigen, wie dieses Verfahren durchgeführt wird, und kann genutzt werden, um Schlüssel quantitative Daten über die Aufnahme Wachstumsdynamik abgeleitet werden. Darüber hinaus kann sie wirksam für teure Antikörper-basierte Zählverfahren ersetzen und kann in Kombination mit anderen fluoreszierenden Markern, wie mKate2 exprimierenden Chlamydia 11 verwendet werden. Diese leistungsstarke Kombination von Werkzeugen ermöglicht Erforschung der physikalischen Eigenschaften des Chlamydien-Aufnahme-Membran im Inneren lebenden Wirtszellen.

Protocol

1. Erzeugung von Leuchtstoff-Wirtszelllinien Tag 1. Platte 293T-Zellen (oder andere retrovirale Verpackungslinie) auf 6-Well-Platten mit 2 × 10 6 Zellen / Vertiefung, zu sein ~ 75% konfluent am nächsten Tag. Falls gewünscht, um die Platte zwei Vertiefungen für jede Retrovirus verwendet werden. Tag 2. Saugen Sie Zellen und 2 ml frisches Wachstumsmedium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin). Transfektion von Zellen mit 5-8 & mgr; g jedes der retroviralen Vektor (enthaltend GFP) und Ver…

Representative Results

Säugetierzellen, die cytosolische fluoreszierende Proteine ​​(zB GFP) kann konstruiert werden, um die Beleuchtung des Chlamydiaeinschlüssen einem lebenden, infizierten Zellkulturen zu ermöglichen. Nach Infektion mit Chlamydia, sind Einschlüsse leicht als schwarze Flecken in den Wirtszellen (Abbildung 1) sichtbar. Die Klarheit der fluoreszenz fehlt Einschlüsse für die automatisierte Identifikation der Einschlüsse in zahlreichen Bereichen und / oder den Behandlungen <…

Discussion

Hier beschreiben wir die experimentelle Strategie zur Erzeugung von Fluoreszenz-Wirtszellen für die Echtzeit-Visualisierung und Analyse von Chlamydia Einschlüsse. Diese Vakuole Visualisierung Ansatz eröffnet die leistungsfähige Möglichkeit, im Laufe der Zeit zu beleuchten, zu verfolgen und quantitativen Messung der dynamischen Eigenschaften von Chlamydieneinschlüsse in Populationen von Zellen oder in Einzelzellen. Chlamydia Einschlüsse in fluoreszierendem Protein markierte Zellen sind auffallend…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).

Materials

Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668
Opti-Mem Invitrogen 31985
Polybrene Sigma H9268
0.45 µm filters Fisher 09-719D
G418 Invitrogen 10131
HBSS Invitrogen 14025
DMEM Invitrogen 11995
RPMI 1640 Invitrogen 11875
RPMI 1640 w/o phenol red Cellgro 17-105-CV
Penicillin G Sigma 13752
Cycloheximide Sigma C7698
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II Nunc 154526, 154534

Referências

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Citar este artigo
Zuck, M., Feng, C., Hybiske, K. Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells. J. Vis. Exp. (104), e51131, doi:10.3791/51131 (2015).

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