Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной<em> Хламидиоз</em> Вакуоли Динамика роста в живых клетках
Summary
A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.
Abstract
The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.
Introduction
Инфекционные заболевания, вызванные видов внутриклеточной бактерией Chlamydia вызвать значительное бремя на здоровье населения, в том числе передающихся половым заболевания, воспалительные заболевания тазовых органов, слепота, пневмония и, возможно, атеросклероза 1-4. Способность Chlamydia, чтобы взаимодействовать с клеткой-хозяином, в пределах вакуоли (называется включение), является критическим фактором для их успешного инфицирования клеток и хостом. Включение роман патогенные отсек, который позволяет рост хламидийной и динамически изменять на протяжении всего 2-3 дней цикла развития хламидий 5. Облигатных внутриклеточный характер хламидий представляет многочисленные проблемы для научного сообщества, в частности для изучения непосредственно уникальную биологию включения. Основным препятствием является неспособность эффективно визуализировать либо внутриклеточный Chlamydia или их включение люминесцентной подходаES в живых клетках. Недавнее открытие, наконец, показал средства для генерации GFP, выражающую С трахоматис 6; Однако, этот вывод еще не привело к конкретному маркировки включения. Некоторые методы были описаны для маркировки бактерий и включений 7,8, но они страдают от недостатков, таких как не-специфичности, мимолетности и восприимчивости к фотообесцвечиванию. Ключевым открытием в нашей группе создана новая стратегия для освещения включение с помощью GFP выражения клеток-хозяев 9. Эта стратегия рационально использует внутреннюю герметичность включения мембраны молекул больше, чем 520 Da 10. Когда клетки инженерии стабильно выразить особую цитозольную флуоресцентный белок (например, GFP или mCherry), Chlamydia включений видны с замечательной ясностью их полного исключения флуоресценции. Эта обратная стратегия изображений позволяет немедленно визуализации включений для всех Хлamydia видов и она может быть легко адаптирована для большинства клеток-хозяев, представляющих интерес. В качестве демонстрации своей полезности, этот метод был использован ранее, чтобы выявить и определить пути выхода клеточные для Chlamydia SPP 9.
Здесь мы также продемонстрировать, как этот метод выполняется, и может быть использовано для получения ключевых количественных данных о динамике роста включение. Кроме того, она может эффективно заменить дорогие на основе антител методами подсчета и может быть использован в сочетании с другими флуоресцентными метками, такими как mKate2 экспрессирующих Chlamydia 11. Это мощное сочетание средств позволяет исследование физических свойств мембраны хламидийной включения внутри живых клетках-хозяевах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем экспериментальный стратегии для генерации флуоресцентных клеток-хозяев для реального визуализации и анализа Chlamydia включений времени. Этот подход вакуоль визуализация дает мощные возможности для освещения, отслеживать и количественно измерить динамические свой?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
Referências
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, S380-S383 (1999).
- Schachter, J., Stephens, R. S. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae–an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T., Stephens, R. S. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
