שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em> כלמידיה</em> חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים
Summary
A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.
Abstract
The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.
Introduction
מחלות זיהומיות הנגרמות על ידי זנים של חיידק כלמידיה תאית לעורר נטל גדול על בריאות הגלובלית, כולל מחלות המועברים במגע מיני, מחלה דלקתית של אגן, עיוורון, דלקת ריאות ואולי טרשת עורקים 1-4. היכולת של כלמידיה לאינטראקציה עם התא המארח, מתוך vacuole (מכונה ההכללה), הוא הקובע קריטי לזיהומם המוצלח של תאים והמארח. ההכללה היא תא פתוגניים רומן המאפשר צמיחת כלמידיה והוא שונה באופן דינמי לאורך כל המחזור ההתפתחותי 2-3 היום השלם של כלמידיה 5. הטבע תאיים לחייב של chlamydiae מציג מספר רב של אתגרים לקהילת המחקר, בפרט לישירות לומד הביולוגיה הייחודית של ההכללה. מכשול עיקרי היה חוסר היכולת לחזות או כלמידיה תאית או ההכללה שלהם על ידי גישת ניאון ביעילותes בתאים חיים. תגלית האחרונה סוף סוף גילתה את האמצעים ליצור GFP להביע ג 6 trachomatis; עם זאת, ממצא זה עדיין לא הוביל לתיוג ספציפי של ההכללה. כמה טכניקות שתוארו לתיוג של חיידקים ותכלילים 7,8, אך הם סובלים מליקויים כגון אי-סגוליות, ארעיות ורגישות לphotobleaching. גילוי מפתח על ידי הקבוצה שלנו הוקם אסטרטגיה חדשה להארת ההכללה באמצעות GFP להביע תאי מארח 9. אסטרטגיה זו באופן רציונלי מנצלת את האטימות הפנימיות של קרום ההכללה למולקולות גדולות יותר מאשר 520 Da 10. כאשר תאים מהונדסים לבטא חלבון מסוים cytosolic ניאון (למשל, ה- GFP או mCherry) ביציבות, תכלילים כלמידיה נראים בבהירות יוצאת דופן על ידי ההדרה המוחלטת שלהם של הקרינה. אסטרטגית הדמיה הפוכה זה מאפשרת הדמיה מיידית של תכלילים לכל Chlמיני amydia וזה יכולים להתאים בקלות למרבית תאי המארח של עניין. כהפגנה של השירות שלה, שיטה זו שימשה בעבר כדי לחשוף ולהגדיר את נתיבי יציאה הסלולריים לכלמידיה spp 9.
כאן, אנו נוספים להדגים כיצד שיטה זו מתבצעת, וניתן לנצל כדי להפיק נתונים כמותיים מפתח על דינמיקת צמיחת הכללה. יתר על כן, זה יכול למעשה תחליף לשיטות ספירה מבוסס נוגדנים יקרות וניתן להשתמש בו במקביל עם תוויות ניאון אחרות, כגון mKate2 להביע 11 כלמידיה. זה שילוב רב עוצמה של כלים מאפשר חקירה של התכונות הפיזיות של קרום הכללת כלמידיה בתוך תאי מארח חיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים את האסטרטגיה הניסיונית ליצירת תאי מארח ניאון להדמיה בזמן אמת וניתוח של תכלילים כלמידיה. גישה להדמיה vacuole זה מקנה יכולת רבת עוצמה כדי להאיר, לעקוב ולמדוד כמותית את המאפיינים הדינמיים של תכלילים כלמידיה פני אוכלוסיות של תאים או בתאים בודדים לאורך ז?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
Referências
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, S380-S383 (1999).
- Schachter, J., Stephens, R. S. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae–an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T., Stephens, R. S. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
